siRNA转染时细胞铺板密度为什么很重要? 分子生物 分子生理...
| 实验方法原理 | 选用Wistar大鼠经消化酶灌注肝脏后,用分离液分离HSC，通过观察其自发荧光及其显著特征性结构的脂肪染色、细胞免疫化学染色等方法鉴定。 | ||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 实验材料 | 雄性SD大鼠 试剂、试剂盒 | 戊巴比妥钠小牛血清DMEM酶消化液I、ⅡNycodenzD-Hanks’液HBSS台盼兰 仪器、耗材 | 手术器械尼龙网相差显微镜荧光显微镜 实验步骤 | 一、实验步骤 1.大鼠腹腔麻醉后在超净台上剖腹，进行门静脉插管。 2.以D-Hanks’液灌注，同时剪开下腔静脉，冲掉血液后，改灌以100ml酶消化液I(0.05%IV型胶原酶)。 3.待肝脏变软后，离体肝脏并剪碎，继续以酶消化液II(含20U/mlDNaseI的0.05%IV型胶原酶)消化15min，尼龙网过滤后以450g离心5min(4℃，下同)。 4.以HBSS重悬沉淀至10ml，再混以20mlNycodenz液，分置于离心管中，并分别覆以2-3mlHBSS，1450g离心16min后取界面细胞。 5.以HBSS重悬后再次离心收集细胞，以DMEM重悬后进行细胞计数，并判断存活率和产量，最后按照常规方法接种(105 细胞/cm2 )，次日换液，以后每2-3天换液一次。 6.传代方法：弃去培液后以D-Hanks’液洗两次，加0.125%胰酶(原代最好加0.05%EDTA)消化，镜下观察细胞突起回缩(2-5min左右)，以完全培液(DMEM+10%NBS)终止反应(若不用EDTA，可以不需离心)，充分吹打后以1:2-1:3接种，然后继续培养(5%CO2，37℃)。
接种次日，光镜下可见细胞呈星芒状，胞质内有脂滴，荧光镜下328 nm处见自发荧光。附照片(图1)。
图1.原代培养第2天的大鼠肝星状细胞 其他 | 一、讨论 进一步鉴别需要做免疫组化：Desmin 和α-SMA；后者在细胞激活后才表达。也采用过无须原位消化的方案，完全可行，只不过消化时间更难控制！实验采用原代培养的或传代后9代内的细胞(最好5代以内)。 二、文献 1.袁桃霞，张锦生，张月娥，等.大鼠肝Ito细胞的体外培养及肝素对其抑制作用的观察.上海医科大学学报,1996,23(2):90-93. 2.HuangGC,ZhangJS,TangQQ.InvolvementofC/EBP-αgeneininvitroactivationofrathepaticstellatecells.BiochemBiophysResCommun,2004,324(4):1309-1318. |
免责声明 本文仅代表作者个人观点，与本网无关。其创作性以及文中陈述文字和内容未经本站证实，对本文以及其中全部或者部分内容、文字的真实性、完整性、及时性本站不做任何保证或承诺，请读者仅作参考，并请自行核实相关内容。
版权声明 未经蚂蚁淘授权不得转载、摘编或利用其他方式使用上述作品。已经经本网授权使用作品的，应该授权范围内使用，并注明“来源：蚂蚁淘”。违反上述声明者，本网将追究其相关法律责任。
发布于 ： 2021-09-17
阅读（283）
▍
相关分类
▍
相关文章
啤酒酵母培养生产单细胞蛋白实验 实验方法
App(Object object) | 微信开放文档 QQ
实验一 巨噬细胞吞噬功能实验
Pepstatin A (天冬氨酸蛋白酶抑制剂)(SG2016100mg)
为什么要构建cdna文库_为什么真核生物需要构建cDNA文库_完美...
人雌三醇(E3)ELISA试剂盒科研专用
redis主从部署使用sentinel做监控 为什么failover 无法切换到 ...
siRNA转染时细胞铺板密度为什么很重要? 分子生物 分子生理...
逆转录酶和反转录酶有什么不同吗?
细胞计数仪器 | 细胞成像仪 | ViCELL XR 细胞计数分析... 贝克曼库尔特
FDA批准来那度胺治疗套细胞淋巴瘤
比较分子生理基因组学—cDNA阵列的异种杂交实验(一)资讯分析...
▍
相关问答
