中国人基因组YAC文库的构建及其应用初探
YAC带有天然染色体所有的功能元件，包括一个着丝粒，一个DNA复制起点，两个端粒。YAC能够容纳长达几百kb的外源DNA，这是质粒和黏粒办不到的。大片段的插入更有可能包含完整的基因，在染色体步移中每次允许更大的步移距离，同时能够减少完整基因组文库所需的克隆数目。
0 收藏 360 阅读1. 尽管当插入片段大于100 kb 时，YAC克隆是可供选择的基因组DNA大片段克隆方法之一，但该系统的一些特性使之很难被迅速采纳为常规克隆手段。
2. 在复杂的酿酒酵母菌的基因组中，通常所用的YAC只是一个单拷贝。
3. 因此在YAC文库中鉴定一个克隆，其信噪比较之在λ噬菌体载体或粘粒载体文库中鉴定同种的克隆更差。
4. 同时，发展一种针对YAC的高密度筛选方法的努力一直步履维艰，仅取得了十分有限的成功，构建YAC文库时不仅需要百倍的努力和巨大的投入，筛选文库时还要耗费大量的人力物力。因此，如果研
5. 究者希望获得含特定序列DNA的YAC克隆，最为可行的方案是首先安排筛选在某中心实验室保存的已有的文库。 6. 最初，YAC文库是用整个棊因组DNA构建的。近来，也有利用携带特定染色体或部分染色体的体细胞杂合体构建文库。
7. 如果靶基因座在染色体上的位置是已知的，那么构建和筛选YAC文库所耗费的人力物力将极大地减少。
1. YAC中心实验室用于筛选文库的方法进展很快。
2. 将一块或多块微量滴定板微孔中的YAC克隆转印到尼龙膜上，用单拷贝探针进行杂交，就可以筛选YAC文库了。
3. 然而，由 于杂交实验的信噪比较低以及制备所有的转印尼龙膜所需的花费巨大，绝大多数实验室已采用PCR方法来筛选文库。
4. 这种方法首先是从克隆集中提取DNA，一般每个克隆集代表1~4块微量滴定板。
5. 然后将从克隆集中提取的DNA合并成一 个更大的超集，约含1 500~2 000个YAC克隆。
6. 用PCR方法筛选这些克隆集和超集，就可以从中找出包含至少一个扩增克隆的候选微量滴定板。
7. 最终的克隆确认可通过采用PCR产物作探针进行常规的菌落杂交，或将微量滴定板按列或行分组再进行PCR分析， 逐步缩小范围最终获得YAC阳性克隆。
8. 验证PCR分析方法的特异性、反应参数、和筛选 复杂的YAC克隆集和亚集一般要花费2~6周时间。
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发布于 ： 2018-08-05
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