KitContents
| 96wellPermethylationplate | 1Plate |
| Dimethylsulfoxide(DMSO) | 40.0ml |
| Dichloromethane(DCM) | 60.0ml |
| 96wellBalancePlate | 1Plate |
| 96wellPlateLid | 1Lid/Mat |
Thepermethylationplate(LC-PERMET-96)isscalableandcanbeusedforanynumberofsamplesbetween1and96.Storetheunusedkitreagentsandtheunusedplatewellsintherecommendedstorageconditionstoenabletheiruseforfurthersamplepreparationatalaterdate.
Note:Duetoshippingrestrictionsofmethyliodide/iodomethane,weareunabletoprovidethiscomponentwiththekit.Werecommendpurchasingiodomethanewithpurity≥99.0%(GC)fromyourlocalchemicalprovider.IodomethaneSynonym:methyliodideCASNumber:74-88-4
| a.Preparationofglycans | Asrequired |
| b.AdditionofDMSOandsampletoplate | 15minutes |
| c.Incubation | 15minutes |
| d.AdditionofMeItopermethylationplate | 15minutes |
| e.Incubation | 60minutes |
| a.Extractionofsamples | 3-4hours |
| b.Dryingpermethylatedsamples | 10-30minutes |
| c.Additionof70%MeOHforstorage | 10-20minutes |
PermethylationReferences
A.Dell;A.J.Reaseon;Kay-HooiKhoo;M.Panico;A.McDowellandH.R.MorrisMassSpectrometryofCarbohydratecontainingBiopolymerMethodsinEnzymology230:108-132(1994)
I.Ciucanu;C.E.CostelloEliminationofOxidativeDegradationduringtheper-O-MethylationofCarbohydratesJ.Am.Chem.Soc.125:16213-16219(2003)
I.CiucanuPer-O-MethylationreactionofstructuralanalysisofcarbohydratesbymassspectrometryAnalyticaChimicaActa576:147-155(2006)
I.Ciucanu;R.CapritaPer-O-MethylationofneutralcarbohydratesdirectlyfromaqueoussamplesforgaschromatographyandmassspectrometryanalysisAnalyticaChimicaActa585:81-85(2007)
Shubhakar,A.,Kozak,R.P.,Reiding,K.R.,Royle,L.,Spencer,D.I.R.,Fernandes,D.L.,Wuhrer,M.AutomatedHigh-ThroughputPermethylationforGlycosylationAnalysisofBIOLOGicsusingMALDI-TOF-MSAnalyticalChemistry.acs.analchem.6b01639(2016).
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一般来讲，进行real-time qPCR MasterMix都是2×的浓缩液，只需要加入模板和引物就可以。由于real-time qPCR灵敏度高，所以每个样品至少要做3个平行孔，以防在后面的数据分析中，由于Ct相差较多或者SD太大，无法进行统计分析。通常来讲，反应体系的引 物终浓度为100-400mM；模板如果是总RNA一般是10ng-500，如果cDNA，通常情况下是1ul或者1ul的10倍稀释液，要根据目的基因 的表达丰度进行调整。当然这些都是经验值，在操作过程中，还需要根据所用MasterMix，模板和引物的不同进行优化，达到一个最佳反应体系。在反应体 系配置过程中，有下面几点需要注意：
1. MasterMix不要反复冻融，如果经常使用，最好溶解后放在4度。
2. 更多的配制Mix进行，减少加样误差。最好能在冰上操作。
3. 每管或每孔都要换新枪头！不要连续用同一个枪头加样！
4. 所有成分加完后，离心去除气泡。
5. 每个样品至少3个平行孔。
在分子生物学中，探针是根据碱基互补的原理，用来与特定的DNA片段做杂交以对特定的DNA片段进行检测，如Southern杂交
引物是用来扩增DNA序列的，因为核苷酸必须要连接在3-OH上才能够合成延伸，引物就是用来提供3-OH的。
只要是符合要求的DNA片段都可以用来做探针和引物，引物是用来扩增DNA序列，探针用来与特定的DNA片段做分子杂交的
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