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제품특징
□ 특징
● 배양 용기면적에 의존하지 않는 3D spheroid culture에서 humaniPS/ES세포 배양 scale up에 유용
● 최적화된프로토콜과 배지 첨가제에 의한 뛰어난 확대 배양 효율 (800배 /11일)
● 3D분화유도 전 배양 프로토콜에도 최적
● 안정된 핵형과분화유도능 유지
● Xeno-free: 동물이나 인간 유래 성분 불포함
□ 제품설명
본 제품은 인간 유래 다능성 줄기 세포(human ES / iPS 세포)의 3D spheroid 배양용 배지로 동물이나 인간 유래 성분을포함하지 않는 chemically defined media이다. 배양용기면적에 의존하지 않고, 배양 스케일 업에 유용하다. 본 제품에서배양한 인간 유래 다능성 줄기 세포는 분화 유도 능력 및 핵형을 유지하고 있다.※ Basal Medium에는 GMPgrade 제품(Code Y30071)도있다.본 제품 이용 시 Cellartis® DEF-CS™ 500Xeno-Free 3D Spheroid Additives (Code Y30048)와 조합해서 사용하십시오.
□ 내용
CellartisDEF-CS 500 Xeno-Free 3D Spheroid Culture Medium w/o antibiotics (Code Y30047) | ||
CellartisDEF-CS 500 Xeno-Free Basal Medium w/o Antibiotics | 500 ml | |
CellartisDEF-CS 500 Xeno-Free 3D Spheroid additives | 1 Set; 배지 첨가제 (CodeY30048) | |
- DEF-CS Xeno-Free 3D SpheroidAdditive 1 (1,000×) | 500 ㎕ | |
- DEF-CS Xeno-Free 3D SpheroidAdditive 2 (4,000×) | 200 ㎕ | |
- DEF-CS Xeno-Free 3D SpheroidAdditive 3 (500×) | 400 ㎕ | |
□ 보존
Cellartis DEF-CS 500 Xeno-Free Basal Medium w/o antibiotics : 4℃Cellartis DEF-CS 500 Xeno-Free 3D Spheroid additives：-15℃ 이하
□ Application data
그림 1. High-quality hiPS cell aggregatesgrown with Cellartis DEF-CS 500 Xeno-Free 3D Spheroid Culture Medium in stirredtank bioreactors (in perfusion mode). hiPS cell aggregates grown under 4% O2perfusion conditions were sequentially passaged three times by mechanicaldisruption (protocol adapted from Otsuji et al. 2014); cells were counted atpassage on days 4 and 7, and at the final time point on day 11, to determinethe expansion factor relative to the initial seeding number.
그림 2. High-quality hiPS cell aggregatesgrown with Cellartis DEF-CS 500 Xeno-Free 3D Spheroid Culture Medium in stirredtank bioreactors (in perfusion mode). hiPS cell aggregates were differentiatedinto definitive endoderm cells using a four-day protocol, then furtherdifferentiated into either lung progenitors (left), hepatospheres (middle), orbeta cells (right) via respective 11-15 daydifferentiation protocols. qPCRdata (not shown) indicated increases in FOXA2 and NKX2.1 expression in lungprogenitors; CYP3A4, AFP, and CYP1A in hepatospheres; and PDX1 and NKX6.1 inbeta cells.
그림 3. High-quality hiPS cell aggregatesgrown with Cellartis DEF-CS 500 Xeno-Free 3D Spheroid Culture Medium in stirredtank bioreactors (in perfusion mode). Representative images of aggregates atdays 1, 2, and 5 after seeding with 2.5 x 105 cells/ml. Viable cells werelabeled with fluorescein diacetate (green) and dead cells with propidium iodide(red).
그림 4. High-quality hiPS cell aggregateswere grown with Cellartis DEF-CS 500 Xeno-Free 3D Spheroid Culture Medium instirred tank bioreactors (in perfusion mode). After expansion of hiPS cells asaggregates, cells were harvested on day 4 and expression of OCT4, SSEA-4,TRA-1-60 (pluripotency markers) and SSEA-1 and SOX17 (differentiation markers)was analyzed by immunostaining.
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http://medgen.ugent.be/rtprimerdb/
探针的标记方式有放射性标记和非放射性标记。标记物质有放射性元素（如32P等）和非放射性物质（如生物素、地高辛等）。32P是最常用的核苷酸标记同位素，被标记的dNTP本身就带有磷酸基团，便于标记。特点是比活性高，可达9000Ci/mmol；发射的β射线能量高。用它标记的探针自显影时间短，灵敏度高。32P的半寿期短，虽使用不方便，但为废弃物的处理减轻了压力。非放射性标记法有酶标法和化学物标记法。酶标方法与免疫测定ELISA方法相似，只是被标记的核酸代替了被标记的抗体，事实上被标记的抗体也称为探针，现有许多商品是生物素、地高辛标记的。血凝素与生物素有非常高的亲和性，当血凝素标记上过氧化物酶或碱性磷酸酶，经杂交反应最终形成探针-生物素-血凝素酶复合物（ABC法），酶催化底物显色，观察结果。ABC法底物显色生成不溶物，以便观测结果。酶标记法复杂、重复性差，成本高，但便于运输、保存，灵敏度与放射物标记法相当。 ①缺口平移标记法。利用的是DNA聚合酶I能修复DNA链的功能。该法先由DNaseI在DNA双链上随机切出切口，然后DNA聚合酶I沿缺口水解5´端核苷酸，同时在3´端修复加入被标记核苷酸，切口平行推移。缺口平移法快速、简便、成本相对较低、比活性相对较高、标记均匀，多用于大分子DNA标记，(>1000bp最好)，但单链DNA、RNA不能用该法标记。
②随机引物法。随机引物是指含有各种可能排列顺序的寡聚核苷酸片断的混合物，因此它可以与任意核苷酸序列杂交，起到聚合酶反应的引物作用。将待标记的DNA探针片断变性后与随机引物一起杂交，然后以此杂交的寡聚核苷酸为引物，在大肠杆菌DNA聚合酶I大断段（KlenowFragment）催化下，合成与探针DNA互补的DNA链，当在反应体系中含有a-32P-dNTP时，即形成放射性同位素标记的DNA探针。具有上述优点，可代替缺口平移法。此外大小、单双DNA均可标记，标记均匀，标记率高，但也不能标记环状DNA。随机引物法标记探针一般长400~600bp。
③末端标记法（又叫尾标）。利用末端转移酶可进行“尾标”，尾标适用于寡核苷酸探针标记，寡核苷酸探针多用于核酸“点”突变的检测，该探针可用核酸合成仪人工合成，克隆出的探针一般较长，特异性好，标记量大，杂交的检出信号强。 1、4—6微米切片，用防脱片胶（多聚赖氨酸）处理过的玻片贴附
2、56—60℃烤片2—16h
3、新鲜二甲苯脱蜡，10minX2（趁热脱蜡）
4、100%乙醇5minX2次，不用浸水，直接空气干燥
5、加入50μl蛋白酶K工作液（蛋白酶K用蒸馏水稀释，浓度为25μg/ml），37℃消化10—15min
6、弃去蛋白酶K工作液，0.1MTBS洗涤3minX3次逐级酒精脱水（85%，95%，100%酒精）1minX3次然后空气干燥
7、加入20μl探针，加盖薄膜。（探针用预杂交液稀释，浓度为5μg/ml）。
8、95℃变性10—12min；立刻置于冰块上，防止复性。
9、37℃杂交16—20h
10、揭去薄膜，每张切片加入以下杂交后洗涤液：
>用2—3滴2XSSC37℃洗涤3minX2次；
>0.5XSSC37℃洗涤3minX2次；
>0.2XSSC37℃洗涤3minX2次；
11、0.1MPBS/TBS缓冲液洗涤，1minX3次
12、滴加小鼠抗地高辛生物素标记的抗体工作液，37℃孵育45—60min；
13、0.1MPBS浸洗，5minX3次
14、滴加高敏碱性磷酸酶链亲和素复合物工作液，37℃孵育45—60min。
15、0.1MPBS浸洗，5minX3次
16、滴加NBT/BCIP显色6—16h，
17、双蒸水终止反应（37℃10min—2h），双蒸水浸洗，5minX2次
18、滴加核固红，30秒—5min；
19、双蒸水浸洗，5minX3次
20、脱水、透明、封片
