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基因探针，即核酸探针，是一段带有检测标记，且顺序已知的，与目的基因互补的核酸序列(DNA或RNA)。基因探针通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交信号，能从浩翰的基因组中把目的基因显示出来。根据杂交原理，作为探针的核酸序列至少必须具备以下两个条件：①应是单链，若为双链，必须先行变性处理。②应带有容易被检测的标记。它可以包括整个基因，也可以仅仅是基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之转录而来的RNA。

引物，又名引子。是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链，之所以需要引物是因为在DNA合成中DNA聚合酶仅仅可以把新的核苷酸加到已有的DNA链上。

小弟最近在用realtimePCR扩增HPV16病毒（双链环状DNA病毒）的一个片段。引物和探针的设计都是参考文献的。东西设计完后做了几天实验一直不出实验结果，心中焦虑万分，怀疑是引物或是探针设计的问题。求教各位达人，能否帮小弟验证一下设计的引物和探针的合理性。
上游引物：5′-GAATGTGTGTACTGCAAGCA-3′
下游引物：5′-GTTGTATTGCTGTTCTAATGTTGT-3′
Taqman探针：5′-FAM-CAGCATATGGATTCCCATCTC-TAMRA-3′
扩增的产物长度是：195bp(nt188-382)
HPV16全长序列：贴在附件中

磕头跪谢！！！

HPV16.txt(9.91k)

是RNA探针。TaqMan 荧光探针是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5’末端，而淬灭剂则在3’末端。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。常用的荧光基团是FAM，TET，VIC，HEX。 而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变（SNP），有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。

如果你做的事荧光定量PCR，其引物和一般引物在构成上是没有什么区别的，只是要更加注意引物二聚体、PCR产物大小等问题。染料法不需要其他东西，探针法还需要taqman探针，这个探针的设计是比较有讲究的，并且上面有荧光集团和猝灭基团。具体设计，一般使用相关软件进行。

如题

引物肯定需要特异性的啊要不然你扩增出乱七八糟的条带对结果影响很大的

看引物能不能特异性扩增，你可以检查一下扩增后的熔解曲线，一般单一的峰是特异性引物，如果有双峰那就是扩出来了杂带

引物是用来扩增片段用的，而探针，探针上面有荧光基团，完整时检测不到荧光，与两引物之间的目的基因结合，PCR扩增过程中，探针被切断，可以检测到荧光。扩增得到的目的基因越多，那么探针被切断的也越多，检测到的荧光也越多，所以常用来做定量PCR。

本人做荧光定量PCR,参照基因选择的GAPDH,望好心人能告知GAPDH基因的引物和探针序列,谢谢

肯定是tagman探针做出来的结果好，但是贵啊。
引物设计略有不一样，但都可用Primer5设计。

上面较高的是样本曲线，下面较低的是未加样本（茎环引物和引物、探针都加入)

是RNA探针.TaqMan 荧光探针是一种寡核苷酸探针,荧光基团连接在探针的5’末端,而淬灭剂则在3’末端.PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时,Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步.常用的荧光基团是FAM,TET,VIC,HEX. 而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析,又可分析基因突变（SNP）,有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台.

（转载，仅供参考）
a)针对双标记探针的引物和探针设计的规则

所选序列应该高度特异。应该选择具有最小二级结构的扩增子。这是很重要的，因为二级结构会影响反应效率。在任何实时应用中期望获得100%的扩增反应效率，这意味着每次循环中，体系内的扩增子都有两倍的增加。如果二级结构在热力学上比寡聚目的基因更稳定，那目的基因的杂交将会失败。二级结构还会阻碍酶的扩增。如果扩增子的二级结构不能避免，则引物的退火温度要相应提高。在整个过程中，我们要进行BLAST和类似的分析，以确保特异性。

通用原则
1，先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近于探针。
2，扩增子的长度应不超过400bp，理想的最好能在100－150bp内，扩增片断约短，有效的扩增反应就越容易获得。较短的扩增片断也容易保证分析的一致性
3，保持GC含量在20％和80％之间，GC富含区容易产生非特异反应，从而会导致扩增效率的降低，及在SG分析中非特异信号。
4，为了保证效率和重复性，应避免重复的核苷酸序列，尤其是G（不能有4个连续的G）
5，将引物和探针互相进行配对检测，以避免二聚体和发卡结构的形成。

b），探针设计指导
1，在设计引物之前设计探针
2，探针的Tm值应在68－70℃之间，如果是目测探针，则要仔细审查GC富含区。
3，探针的5’端要避免有鸟氨酸，5’G会有淬灭作用，即使被切割下来这种淬灭作用也还会存在
4，选择C多于G的链作探针，G的含量多于C会降低反应效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针。
6，探针应尽可能的短，不要超过30个bp。
7，检测探针的DNA折叠和二级结构。

c), 引物设计指导
1，引物的Tm值应在58－60℃之间，这非常重要，因为我们的试验一般都使用退火温度为60℃，在这个温度下，5’核酸外切酶的活性最高。
2，引物末端（最后5个核苷酸）不能有超过2个的G和C。
3，将引物尽量接近于探针

d循环参数
当引物和探针按照上述原则设计好后，循环的参数也就确定了，当经过起始的变性温度后(根据Tag酶要求设定)，反应要经过95℃，15－20秒，60℃60秒，对于一些模板，45秒也足够了。数据在退火时检测。

e)怎么优化探针和引物的浓度
对于双探针反应，通过选择探针和引物的浓度来优化反应结果，，能获得最低的CT值，以及相对于背景来说荧光值有最高的增长。

引物浓度应该在50nM -900nM 范围内进行优化，下面的表格显示了前后引物9种可能浓度组合的结果
探针浓度应该在50－250nM范围内优化
前引物
后引物50300900
5050/50300/50900/50
30050/300300/300900/300
90050/900300/900900/900
探针的浓度应该从（50，100，250nM）与9种引物浓度相组合，也既是27种可能根据前面所述的循环参数，在Rotor-Gene上进行试验，
选择最小CT值和最高反应扩增的曲线做后续试验。
g)进一步的提示
通常所用的探针和引物浓度分别为250nM 和900nM，绝大多数反应都可以在这个浓度下进行，但为了寻找最佳的浓度，还是应该依照上述的步骤。
由于引物溶解温度预测的差异和多种探针设计程序，因此使用三种退火温度（58，60，62℃）对优化是很有用的。
引物的浓度也会影响溶解温度，高的引物浓度会让溶解温度提高2度左右。
Primer3是个非常有用的软件，但他不能避免3‘端的G，所以我们将3’端的G去除，并观察探针的退火温度是否比引物高8－10度。

f)定量数据的分析
分析定量数据主要有两种基本的方法
i)绝对定量
ii)相对定量
研究人员应该根据扩增子和试验目的来决定如何分析定量数据
h)绝对定量
绝对定量是将未知样品与标准曲线相比较进行分析，一般标准品就是一个已知绝对浓度的DNA样品，关于何种标准品用于标准曲线一直有很多讨论，理想的标准品其扩增方式应该是与待测样品一致得，然而这往往是不可能的。一些人会克隆他们得目的基因，并与未知样品比较。要注意得是，绝对定量分析的准确性是依靠标准品的准确性得。

在Rotro-Gene 上可以用几种方法来分析绝对定量数据。包括标准曲线在内的，R值，反应效率都会被呈现出来。也可以从以外的分析中调用标准曲线并让它与一个标准品相调整，（或重复相同的标准品），这个功能在确定斜率的重复性好与Y截距的基础上完成。对一个标准曲线来说，一个单独的标准品就已经足够了。我们也可以在不同的通道甚至一个通道内绘制多条标准曲线。最后提到的功能主要是为了那些想用SYBR-Green分析两个基因的使用者。
ii)相对定量
相对定量是指两个或更多的基因互相进行比较，其结果是一个比率。没有确切的数字被检测道。一种检测基因表达相对定量的方法叫“比较CT值法（⊿⊿Ct）
这种方法可以彻底不需要标准曲线，通过观察与一个动态相关对照比较的表达水平（normalizer），从而可以将模板与增加的样品间进行相对定量。要使这种方法成功，目的及参照的动态范围应该相类似。相对的一个敏感的方法就是看⊿Ct（相同的起始模板浓度，两个扩增子的两个CT值的差异）随着不同稀释度的模板有什么变化。如果两个扩增子的反应效率大致相同，则the plot of log input amount versus ⊿Ct 将是一条水平线（斜率<0.01）。这以为着在初始模板浓度范围内，两个扩增子有相同的反应效率。如果检测发现效率不一致，则应该用标准曲线来对基因表达进行定量，或优化反应使得获得一个类似的效率。动态范围应该有下面两点决定（1）目的基因使用最小和最大的浓度其结果都是准确的（2）两个基因的最小和最大的定量比值都是准确的）