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incell
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M3:D
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Description

M3:BaseA™ is a proprietary, serum free, highly enriched culture media for stem cells and other fastidious human and mammalian cell types.

It is the same formula as M3:BaseF™ but also contains antibiotics (see information sheet) as well as numerous growth factors, supplements, and buffers. Propagation of dividing cells may require an addition of attachment factors, blood components or serum additives, depending on cell type. M3:BaseA™ is used as a basal medium. The addition of 10% v/v high quality fetal bovine serum (FBS) equals the M3:10A™ formula.

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各位大神求助,本人用TATARA的逆转录试剂盒进行逆转录过程,该过程为37度15分钟,85度5秒一个循环完成,我没注意今天让它跑了25个循环,反应体系里包含总RNA,逆转录引物(oligodT和随机引物6),dNTP,这样子会反复扩增CDNA么?因为有底物有引物在85度条件下不知道RNA会不会失活,就算RNA失活,以cDNA为模板,会不会进行扩增呢?谢谢各位啦

可以。比如化学本质为蛋白质的酶在蛋白酶的作用下发生水解,此时该酶就是被作用的底物了。
我做了ELISA方法学建立的实验,可惜按照三版全国临床检验规程上的方法配制底物液,显色偏浅,请高手指教,或者给我新的配方.或者给我指导,谢谢!
可以考虑以下几种情况:

1,底物DNA上没有该限制酶的识别、切断位点。特别是一些经过重组等处理的DNA,碱基易发生缺失、变化等。

2,限制酶识别位点上的A或C被甲基化。部分限制酶对识别位点中的碱基是否被甲基化比较敏感,从而无法切断该位点。

3,底物不纯。如果底物DNA中有限制酶阻害物质,回影响限制酶的酶切作用。在此种情况下,底物DNA须重新进行精制。

4,限制酶的识别、切断位点在底物DNA的高级构造中所处的位置,对酶切反应也有一定的影响,例如,限制酶NaeI在切断pBR322DNA时,就有着非常难以切断的部位。

5,限制性内切酶本身无活性或低活性
不算,酶作用于反应底物,ATP提供能量
不算,因为酶和ATP反应前后总量不变。当然,蛋白酶和RNA酶不算(大部份酶由蛋白质构成,少部分由RNA构成)
我用的试剂盒是avivasystem的,TMB底物加入之后感觉反应太过剧烈,加入之后高浓度的孔立即就开始变蓝,说明书是37度15-30分钟,孵育恰当的标准是:高浓度四孔变蓝色,低浓度(包含空白孔)无明显蓝色。我实际操作过程中,37度孵育15分钟已经全部孔变蓝,最终测下来od值过高,标曲八个点,空白0.2+,高浓度两空3以上,结果就是前六个点还是线性挺好的(r=0.9991),高浓度两个点完全不行。另一个问题是:我摸索了待测血清的稀释浓度,分别是不稀释、1/10、1/50、1/100,结果不稀释和1/10两个浓度测出来是负值(od小于空白对照),1/50和1/100测出来的值在标曲范围内(只取了线性好的前六个点),但是测值和稀释倍数也不成比例。请教各位:1.听人说TMB底物常温避光反应也可以,我能不能常温呢?这样我就好控制反应时间,还是继续37度孵育,把孵育时间缩短到10分钟甚至5分钟2.高浓度血清标本(不稀释、1/10稀释)测出负值应该怎么解释,厂家技术支持说可能浓度太大影响抗原抗体结合,这个能说得通吗?3.空白孔是不是应该不变色才对?空白孔显色是不是洗板时孔间污染导致的?要是这样的话,为什么前六点(含空白)标曲是好的?谢谢大家了