Cell Line Information:
Designations: 3197-3Depositors: JE DeLarcoGrowth Properties: adherentOrganism: Mus musculusMorphology: fibroblastOrgan: embryoCell Type: fibroblastAge: embryoThe cells were derived from ATCC CCL-92 by transformation with Moloney murine sarcoma virus. They release a growth factor in serum free medium. They do not produce virus particles. The cells have a tendency to slough off the flask surface. Tested and found negative for ectromelia virus (mousepox).
The Transfection Reagent:
3197-3 Cell Avalanche™ Transfection Reagent is a new, proprietary solution specifically designed for transfection on 3197-3 Cells. The proprietary formulation of lipids and polymersensures the highest possible transfection efficiencies and viabilities for 3197-3 Cells. No other transfection reagents can match the efficiency, convenience, and gentleness of 3197-3 Cell Avalanche™ Transfection Reagent for transfection on 3197-3 Cells. For details of the developing process of this reagent, please go to: How did EZ Biosystems develop Avalanche™ Cell type/cell line specific transfection reagent series?
Features:
- Unique formulation-maximize transfection performance in 3197-3 Cells.
- Extremely gentle to cells
- 0.5 ml is able to transfect about 1000 wells of 24-well plate
- Deliver single or multiple plasmids
- Synthesized from 100% animal origin-free components, making it easy to validate the absence of zoonotic diseases, such as BSE or viruses, in research experiments or cells lines
- Economical: High efficiency means less amount of nucleic acid & reagent is needed
- Developed and manufactured by EZ Biosystems
EZBiosystems美国EZBiosystems™公司是一家全球性转染试剂和基因表达生产服务提供商，公司的研发宗旨是让生命科学研究变得更简单，快速，容易！该公司主要产品之一为新一代转染试剂Avalanche 系列产品，该产品集合了组合化学，分子生物学和细胞生物学技术。公司致力于开发针对不同细胞类型的专用转染试剂。公司研发团队由多个学科经验丰富的专家组成，包括组合化学、脂类化学、生物物理学、分子生物学和细胞生物学。目前,EZBiosystems™主要提供广谱性基因及siRNA体外转染试剂、体内转染试剂、生物治疗性蛋白表达专用转染试剂以及150余种细胞特异性转染试剂。
EZBiosystems特约代理EZBiosystems品牌名称：EZBiosystemsEZBiosystems品牌logo：EZBiosystems品牌官网：http://ezbiosystems.com/EZBiosystems品牌链接：http://www.annoron.com/brand-342.htmlEZBiosystems品牌介绍：EZ生物系统™是一家全球性的基因转染和基因表达产品和服务提供商。EZBiosystems™isaworldwideprovideroftransfectionandgeneexpressionproducts&services.OneofthemajorfocusesofEZBiosystems™hasbeentheresearch,development,andmanufactureofnext-generationtransfectionreagents----theAvalanche®TransfectionReagentseriesbyapplyingourexpertiseincombinatorialchemistry,molecularBIOLOGy,andcellbiology. EZBiosystems品牌相关产品：品牌货号名称规格EZ BiosystemsEZT-CRPR-1Avalanche®-CRISPR Transfection Reagent0.5ml 1.5mlEZ BiosystemsEZT-OMNI-1Avalanche®-Omni Transfection Reagent0.75ml 1.5ml5*1.5mlEZ BiosystemsEZT-EVDY-1Avalanche®-Everyday Transfection Reagent0.75ml 1.5ml
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1、如果是提取的总蛋白，然后做WB，用β-actin或者GAPDH做内参肯定是没有问题的，这是公认的东西。
2、如果用膜蛋白提取试剂盒提取蛋白，再用β-actin作为内参似乎不妥，因为理论上来讲β-actin在膜上是不表达的。WB能做出β-actin来是因为膜蛋白提取时把胞质蛋白也提出来了。然而，如果我们试验目的是用药物处理细胞，比较处理前后某种膜蛋白的表达情况，此时用膜蛋白提取试剂盒提取膜蛋白后再用β-actin做内参似乎就不妥了，因为你根本不知道药物处理前后混杂了多少的胞质蛋白进来。如果没有胞质蛋白混进去的话，β-actin就是检测不到的。
第一，血清成分复杂，最好用密理博的Montage Albumin Deplete Kit去除血清里50%的白蛋白
第二，磷酸化蛋白提取蛋白的时候，最好加入原钒酸钠，和磷酸酶抑制剂，防止蛋白脱磷酸化。
第三，不要用牛奶做封闭剂，用BSA。因为牛奶中含有磷酸化酪蛋白，防止非特异带。
第四，如果条带杂带多，而且，条带弱，可以选择millipore的signal boost，增加条带特异性，而且，增强条带的亮度。
考马斯亮兰染液也可以重复用。新配的染液10分钟即可，重复3次后要染30分钟。
一抗二抗可以重复利用,但是注意要在5%milk中加入0.2% sodium azide ,并且用完以后放入4度保存,我的经验重复使用4-5次是肯定没有问题的.如果保存不当,就会污染微生物,只能丢弃.
一、广口瓶。
广口瓶是用于盛放固体试剂的玻璃容器，有透明和棕色两种，棕色瓶用于盛放需避光保存的试剂（例如硝酸银等大部分硝酸盐）。广口瓶一般用于存放试剂，瓶口内部磨砂，用于与瓶塞配合使用。
取用试剂时，瓶塞要倒放在桌上，用后将塞塞紧，必要时密封。由于瓶口内侧磨砂，一般跟玻璃磨砂塞配套，因而玻璃塞的广口瓶不能盛放强碱性试剂。如果盛放碱性试剂，要改用橡皮塞，因为强碱与玻璃中的二氧化硅反应，生成硅酸盐，使口与塞粘连。
二、细口瓶。
一种用于存放液体试剂的玻璃容器，细口方便液体倾倒，并且能够避免试剂挥发，因此口比较小。有透明和棕色两种，棕色瓶用于盛放需避光保存的试剂。
取用试剂时，瓶塞要倒放在桌上，用后将塞塞紧，必要时密封。由于瓶口内侧磨砂，一般跟玻璃磨砂塞配套，因而不能盛放强碱性试剂。如果盛放碱性试剂，要改用橡皮塞。
之前是担心所需组织量不够（要求是200-300mg，我的组织只有20mg左右）才跑不出来，后来换用大鼠心脏测试，组织量绝对够。。。而且在跑western之前进行了说明书上的蛋白浓缩步骤，可是在加loADIngbuffer之后，蛋白沉淀怎么都溶解不掉~说明书也注明了如果有沉淀可以取上清继续上样，可是每次上样感觉样品往上浮，只有部分样品往孔里沉，而且跑出来什么都没有，连内参都没有。用的是β-actin的内参。。
western之前浓缩步骤如下:
1、取所得提取物，每100ul膜蛋白加入约300ul的溶解buffer和约100ul三氯乙酸（TCA）试剂，混匀后置冰上20-30min后，13000rpm，离心15min，尽可能去除上清。
2、沉淀加入1ml丙酮，室温静置10min后，13000rpm离心15min。
3、弃上清，沉淀真空旋干或置冰上干燥10min（敞开离心管盖），按适当体积比加入loadingbuffer（使用前没100ulloadingbuffer加入2-5ulβ-巯基乙醇）溶解，彻底分散（枪头反复吹吸或剧烈涡旋），煮沸5min。【注：加入loadingbuffer后如有部分难容物，可取上清继续上样。】
