Overview:
DCAMKL1 or doublecortin-like kinase 1 contains two N-terminal doublecortin domains (which bind microtubules and regulate microtubule polymerization), a C-terminal serine/threonine protein kinase domain (which shows substantial homology to Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase), and a serine/proline-rich domain in between the doublecortin and the protein kinase domains (which mediates multiple protein-protein interactions) (1). DCAMKL1 is a microtubule-associated kinase that can undergo autophosphorylation. DCAMKL1 has microtubule-polymerizing activity that is independent of its protein kinase activity (2). DCAMKL1 is involved in several different cellular processes, including neuronal migration, retrograde transport, neuronal apoptosis and neurogenesis.
Gene Aliases:
DCLK1; DCDC3A; DCLK; KIAA0369
Genbank Number:
NM_004734
References:
1. Ohmae, S. et.al: Molecular identification and characterization of a family of kinases with homology to Ca(2+)/calmodulin-dependent protein kinases I/IV. J. Biol. Chem. 281: 20427-20439, 2006.2.Lin, P. T. et,al: DCAMKL1 encodes a protein kinase with homology to doublecortin that regulates microtubule polymerization. J. Neurosci. 20: 9152-9161, 2000.
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在进行RT反应之前,应考虑以下几个方面:
1、RNA
成功的cDNA合成来自高质量的RNA,高质量的RNA至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂,如EDTA或SDS。在提取RNA的过程中,要特别防止RNase的污染,同时在逆转录反应中经常加入RNase抑制剂以增加cDNA合成的长度和产量。RNase抑制剂要在第一链cDNA合成反应中,在缓冲液和还原剂(如DTT)存在的条件下加入,因为cDNA合成前的过程会使抑制剂变性,从而释放结合的可以降解RNA的RNase。蛋白RNase抑制剂仅防止RNaseA,B,C对RNA的降解,并不能防止皮肤上的RNase,因此尽管使用了这些抑制剂,也要小心不要从手指上引入RNase,实验过程中经常更换新手套。
2、引物的选择
OligodT
选择OligodT时,要求RNA必须有PolyA,所以真核生物的mRNA都适用。适合长链甚至全长mRNA的RT,所以对RNA样品的质量要求较高,最好不要有明显的DNA污染、RNA降解和RNA断裂。假如想探索新的mRNA进行RT反应,建议推荐使用OligodT引物。使用OligodT引物要比随机引物和特异性引物的稳定性要好。
随机引物
适合各种RNA的RT,尤其适合模板丰度很低的情况(比如某个gene表达量很低)。选择随机引物时,第一链cDNA合成反应中就是以所有的RNA为模板,然后进行PCR反应时设计引物进行特异性扩增。同时要注意随机引物的量和总RNA量之间的关系,一般建议每5μg总RNA的随机引物的用量为50ng,如果每5μg总RNA的随机引物的用量超过250ng,可能会导致小片段产物(<500bp)的增加和长片断、全长产物产物的降低。
特异性引物
特异性引物只能用你设计引物时的下游引物做RT,引物设计质量影响RT的结果,而且不同引物退火温度本来就不相同,所以按照说明书按照一个温度做不是最佳选择,一般不推荐。向左转|向右转
2、取灭过菌且无核酸酶的0.2ml离心管,依次加入2~5μgRNAnμL
3、65℃保温5min,然后冰浴5min;
4、往3步骤中的0.2ml离心管依次加入下列组份
RNase抑制剂(40u/μL)0.5μL
10×M-MLVReactionBuffer2μL
DTT(200mM)1μL
逆转录酶(M-MLV)1μL
5、轻轻混匀后,然后2000rpm离心20s;
6、先在37℃保温1hr,然后70℃保温15min;
7、上述产物可立即进行下一步的PCR反应或-20℃保存。向左转|向右转

