| 实验方法原理 | |||||||||||
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| 实验材料 | 待转化的酵母菌株 试剂、试剂盒 | YPD培养基YPAD培养基：添加30mgL腺嘌呤半硫酸的YPD培养基高纯无菌水l0×TE缓冲液pH7.5无菌10×乙酸锂储液：1molL乙酸锂pH7.5(用稀乙酸调pH)过滤除菌DNA：高分子质量单链载体DNA和待转化DNA50%(mV)PEG4000或PEG3350(不能用PEG8000)过滤除菌CM缺失成分培养基平板用Difco琼脂制备 仪器、耗材 | 恒温摇床、水浴锅 实验步骤 | 1)在开始实验前2天，接种待转化的酵母菌株的单菌落于5mLYPD培养基中，于30℃恒温摇床，培养过夜达到饱和。 2)转化的前一天晚上，往1L无菌烧瓶中加入300mLYPAD培养基，然后接种适量的饱和培养液，再于30℃培养过夜，到细胞密度为1×l07细胞/mLOD600=0.3〜0.5，依据菌株而定）。为了获得2〜3倍高的转化效率，此时用新鲜的YPAD培养液稀释使细胞密度为2×106细胞/mL，然后培养生长1〜2代（2〜4h)。 因为生长期和细胞密度对获得最佳的转化效率是十分重要的，因此最简单的方式就是在3个不同的烧瓶中分别接种不同体积的饱和培养液，例如，在12h的生长期可尝试加入1μL、5μL和25μL过夜培养液，然后在第2天检查每个烧瓶中培养液的OD600值。 3)培养液在室温条件下4000g离心5min，收集细胞。细胞用10mL无菌超纯水重悬，然后转移到一个更小一些的离心管中，再于室温下5000〜6000g离心5min,沉淀细胞。 4)细胞用1.5mL锂盐溶液重悬，锂盐溶液按下列方法配制，现配现用： 1体积10×TE缓冲液，pH7.5 1体积10×乙酸锂储液8体积无菌超纯水 5)每次转化时，200载体DNA和<5转化DNA—起加入1.5mL微量离心管中混匀，DNA的总体积<20μL。 要获得最佳的转化效率，转化之前要重复对载体DNA进行变性循环处理（沸水浴和冰浴）。 6)往每个离心管加入200μL用锂盐溶液重悬的细胞悬液，再加入1.2mL新鲜配制的PEG溶液。PEG溶液配方为： 8体积50%PEG 1体积10×TE缓冲液，pH7.5 1体积10×乙酸锂储液30℃摇荡温育30min。 7)于42℃热激15min,室温下离心5s,细胞沉淀用200μL〜1mL1×TE缓冲液（从10×储液新鲜配制）重悬，并取其中200μL涂布在Difco琼脂制备的CM缺失成分培养平板上。30℃培养2〜5天，直到出现转化子。 注意事项 | 注意：所有溶液和与酵母细胞接触的玻璃器皿必须是无菌的。在玻璃器皿上任何痕量的去污剂都可降低转化的效率。另外，用于配液和清洗玻璃器皿的水必须具有很高的纯度。 其他 | 最常用的酵母菌转化方案，不仅快捷，而且转化效率高。 |
