Cell death or cytotoxicity is classically evaluated by the quantification of plasma membrane damage. Lactate dehydragenase (LDH) is a stable enzyme, present in all cell types, and rapidly released into the cell culture medium upon damage of the plasma membrane. LDH activity, therefore, can be used as an indicator of cell membrane integrity and serves as a general means to assess cytotoxicity resulting from chemical compounds or environmental toxic factors. BioPioneer’s LDH Cytotoxicity Assay Kit measures LDH activity present in the culture medium using a coupled two-step reaction. In the first step, LDH catalyzes the reduction of NAD+ to NADH and H+ by oxidation of lactate to pyruvate. In the second step of the reaction, WST-1 uses the newly-formed NADH and H+ to catalyze the reduction of a tetrazolium salt to highly-colored formazan which absorbs strongly at 450-490 nm.
Kit Components:
WST-1 substrate Mix
Assay Buffer
Cell Lysis Buffer
Stop Solutions
LDH (0.1mg/ml)
User Manual
ebiomall.com
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
⑴测序是为了验证扩增产物是否为自己的目的产物,既然我的产物长度符合要求,那么有必要进行测序吗?②对于荧光定量检测,我先前的那对引物可以接着用吗?③如用ABI7700采用Taqman探针法检测,探针的设计是自行用软件(如primer5.0)或参考文献提交公司合成(像PCR引物合成)那样吗?④看到有的文章介绍,探针是国外的、国内的,这是什么意思?依我的理解:就像PCR引物合成,只要合成正确,荧光标记完好,国外国内不都一样吗?⑤看到有相应试剂盒提供,其提供的东西有哪几样?是不是探针,引物都包括了,对于那些常见的基因都有相应的试剂盒卖吧,关键是价钱贵吗?
看到一个同事做一课题就是设计荧光定量PCR检测某产物,结果半年也没搞出来,令我感到很生畏。现在还有很多临床病原微生物的荧光定量检测还未成功,有的还需优化,是不是设计较困难,哎呀,还未做,就感到力不从心了,大家帮帮我
荧光定量PCR原理等大家都已经很熟了,我就不细说了,主要是写一些有人问过的事,希望写的内容是大家都关心的。
普通PCR与荧光定量PCR技术区别?
简单的讲PCR技术最早是用于扩增一段特异的PCR片段,用于克隆、测序等实验,后来也将其用于样本中特异的PCR片段有无或非很粗的相对定量,而荧光定量PCR技术则是为了测定样本中特异的PCR片段相对及绝对量,是一种测定特异的PCR片段含量的方式。如测定病人样本中病原体的含量、实验样本中某一特定的mRNA的含量等。
前些年有人讲过普通PCR后,通过电泳也可以进行定量,其实是将PCR产物的定量与PCR样本中模板定量相混了。近两年没有人再讲这类的话了。
SybrGreen、Taqman、Molecularbeacon、LUX这些方法如何选择?
从实验成本来讲,SybrGreen是最好的,基本上就是普通PCR加上一点SybrGreenI荧光染料即可,其信号强度也很好,还可以进行融解曲线分析等,但缺点是只能在一个反应管内进行一种PCR反应的检测,另一个问题是非特异性扩增会影响实验结果,当然也有一些技术解决这些问题,后面会讲到。对于研究人员来讲,如果需要检测的基因很多,而每个反应管中进行一种PCR反应的检测可以满足实验要求,则SybrGreen是最好的选择。
如果需要进行多通道实验,即在一个反应管中进行2种或以上的反应,则要选择其他的方法,最常用的是Taqman、Molecularbeacon,这两种都是探针的方式,由于增加了探针的特异性,因此其扩增曲线反映的就是特异性产物的扩增曲线,不含有非特异性扩增的成分。因此商业用途的检测试剂盒大都采用这一技术,以减少非特异性产物造成错误结论的可能性。其缺点在于探针成本较高,有时设计的探针并不合适,有造成损失的可能性。并且要进行较多的实验条件的优化。这两种探针技术用于商业目的时都有专利问题,据说取得Molecularbeacon的许可权的成本相对较低,但只是据说。
另一种值得一提的是LUX探针,它也可进行多通道实验,但它没有Taqman和Molecularbeacon方法的增加探针特异性的功能,因此只能是一种折中的方案,如果不考虑多通道实验,则不如SybrGreen法.
鼓励性加分
我也想问一下。