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제품특징
□ 특징
● Inputs as low as 10 ng of purified total RNA
● Streamlined workflow for specific enrichment of transcripts of interest
● Generate Illumina®-ready, full-length sequencing libraries from the enriched DNA
● Ligation-independent sequencing adapter addition for library preparation
□ 제품설명
SMARTer®Target RNA Capture for Illumina®는 enriched totalRNA로부터 cDNA NGS Library 제작을 위한complete system이다.Targeted RNA-Seq은 적은 양으로 존재하는일부 전사체 (transcript)의 sequence coverage와검출 강도를 높일 수 있으므로 기존의 전장 전사체 분석 (Whole transcriptomeamplification (WTA) RNA-Seq)의 여러 가지 한계점을 해결할 수 있다. 또한기존의 WTA 방식에 비하여 실험 방법이 보다 단순하여 분석 비용을 절감할 수 있다. cDNA합성 전, 분석하고자 하는 RNA 전사체만 특이적으로농축 (Enrichment)함으로써 chimeric genefusion, transcript isoform, splice variants 등 시퀀싱 과정에서 손실되거나 더 많은 양의 sequencing read number를 요구하는 RNA 전사체의정보를 효과적으로 잡아낼 (capture) 수 있다. 이에따라 NGS 데이터의 signal-to-noise ratio의비율을 감소시킬 수 있으므로 보다 높은 민감도와 분석능으로 NGS 분석을 시행할 수 있다. SMARTer® Target RNA Capture for Illumina®의실험단계에서 total RNA 샘플은 연구자가 디자인한biotinylated DNA probe와 total RNA sample을 Hybridization된다. Hybridized RNA-DNA Complex는정제 후, streptavidin이 코팅된 magneticparticles - Capture beads에 의하여 분리 (Capture)된다 (그림 1.) Capture Beads는 단백질과 핵산에 낮은 흡착력을보이기 때문에 PCR 또는 역전사 반응과 같은 추후 실험 반응 (downstreamreaction)에 영향을 미치지 않는다. Capture beads는 SMARTer® Target RNA Capture for Illumina® 제품 내에 포함되어 있으며, 별도로 구매 가능하다 (Code 635039).본제품은 Clontech 특허의 SMART-Seq®v4 Ultra Low Input Kit for Sequencing 기술의 민감도가 결합되어 있어, enriched transcript로부터 고품질의 full-length Cdna를합성할 수 있으며 10ng의 RNA로부터 Targeted RNA-Seq Library를 제작 가능할뿐만 아니라 Clontech 자사 데이터에 의하면 100pg의 total RNA input에서도 성공적인 실험결과를 보였다 (TechnicalNote 확인하기). 본 제품은 oligo(dT) priming을 이용하며 high-quality RNAsample을 필요로 하며 추가적인 rRNA 제거 과정이나 시약을 필요로 하지 않고 제조된 NGS Library는 Illumina® NGS Platform로분석 가능하다. 
그림 1. SMARTer® Target RNACapture for Illumina® protocol overview. The protocol through validation is completed over two days, withjust 2.5-3 hours of hands-on time and without the need for additional rRNAremoval methods or kits.
그림 2. Example electropherogram results from Agilent 2100 Bioanalyzer. Unless indicated, 10 ng of Control Total RNA was subjected tohybridization with HPRT1 Control Probes, capture with Capture Beads, SMART-Seqv4 cDNA synthesis, and amplification for 20 cycles as described in theprotocol. Panel A shows a single distinctpeak between 1,400-1,650 bp. Panels B and C show no productin the negative controls (no RNA and no probes, respectively). Panel D shows the cDNA profile resulting from 10 ng of Control Total RNA hybridized toprobes for 10 different genes, following amplification for 17 cycles.
□ Application
- Sequencing library preparation fortargeted RNA-seq from purified total RNA - Illumina®-specific NGS sequencing libraryproduction - Detection of rare gene fusion events atlow sequencing depth
□ 구성품
- SMARTer Target RNA Capture for IlluminaComponents- SeqAmp™ DNA Polymerase
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2.加大辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素；
我现在用商品化的试剂盒进行夹心法ELISA测定某抗体的浓度，盒子给定了4个标准品，标准品抗体浓度为70000~1000单位，测定步骤中要求对样品进行1:1000稀释后测定。
但是有的样本按照1:1000稀释后，最终OD值大于70000浓度的标准品的OD值，然后使用ELISACALC软件进行四参数拟合，超过了标准曲线的范围，就算不出来这个样品的浓度，但是如果在1000-70000之间的OD值就可以算出相应浓度。请教大神们，接下来我是否可以对样品进行1:2000,1:4000浓度稀释，算出结果后再×2、×4，算作此样品的浓度呢？还是直接给一个＞70000的定性结果？或者可以有能算出来的其他软件？
Ps试剂盒中提及Dilutionlinearity（稀释线性？）为141%，这个是什么意思呢？
多谢！！
请大家帮帮忙，第一步加完抗原后必须封闭吗
目前，我用该蛋白的鼠源性单抗来包被ELISA板子，5%BSA37度封闭二小时后，洗涤四次后将板子分三个组加入抗原：其中一个组中加入的是我重组的蛋白，另一个组为用其它方法证实含该蛋白的人体内血清，最后一个组加入PBS。37度一小时后洗涤四次后每孔加入我制备的兔源性多抗。37度一小时洗涤六次后我再加入酶标记的抗兔的抗体37度40分钟后洗涤六次后TMB显色。
问题就在我显色后所有的孔都是阳性，其中以抗原为我的重组蛋白组与PBS组OD值最高，两组都可以达到1.8以上，而加入的抗原为人体血清组低，为0.6-1.0不等。
后面我优化条件，封闭液用过5%的脱脂奶粉，2%的BSA，包被的单抗浓度摸了梯度，加入的多抗也摸了梯度，酶标的抗体也摸了梯度。结果都没有改变，连趋势每次都是一样以重组蛋白组与PBS组OD最高。
今天我还试着把抗原换成其它蛋白也做出了强阳性？
请教各位高手，我的ELISA该如何往下面做了啊，是不是我的抗体本身有问题呢？
对了，我包被用的单抗是用GE公司的预装柱纯化的，很纯，在考染中是看不到一条杂带的。
ELISA双抗体夹心法(enzyme linked immunosorbent assay——sandwich technique)的原理是将特异性抗体结合到固相载体上形成固相抗体，然后和待检血清中的相应抗原结合形成免疫复合物，洗涤后再加酶标记抗体，与免疫复合物中抗原结合形成酶标抗体-抗原-固相抗体复合物，加底物显色，判断抗原含量。
生物帮有相关介绍。编码RNA http://doc.bio1000.com/show-3399.html
（2）封闭：将已包被的板用洗涤液洗涤2次，每孔加入120 μL封闭液，封闭一段时间，取出，甩干备用。
（3）竞争反应：在制备好的板中每孔加入50 μL系列浓度的标准品溶液和50 μL稀释好的酶标抗体溶液，孵育一段时间。
（4）洗板：用洗涤液洗涤5次。
（5）显色反应：每孔加入显色溶液100 μL，孵育一段时间。
（6）终止：每孔各加入终止液，在酶标仪上测定各孔的吸光值。
