Polyclonal Antibodies Gyrase (isolated from Rabbit Blood)
All antibodies are stored in Phosphate Buffered Saline (PBS) pH 7.2.Store at -20°C. (stable for at least 12 months undiluted).
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Anti-Gyr A
Raised against the E. coli gyrA subunit, anti-Gyr A polyclonal antibodies were isolated from rabbit blood. The antibody is supplied at a concentration requiring ~1:1,000 dilution for Western blotting.
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Anti-Gyr B
Raised against the E. coli gyrB subunit, the anti-Gyr B polyclonal antibodies were isolated from rabbit blood. The antibody is supplied at a concentration requiring ~1:1000 dilution for Western blotting.
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References
- Ey, P.L., S.J., & Jenkin, C.R. (1978). Isolation of pure IgG1, IgG2a, and IgG2b immunoglobulins from mouse serum using Protein A sepharose. Immunochemistry. 15: 429-436
- Harlow, E. & Lane, D (1988). Antibodies: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory press. Cold Spring Harbor
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对于新手来说购买反转录试剂盒是比较理想的,买一个kit看看说明书操作就可以了。推荐两款kit TAKARA和HaiGene,这两款试剂盒都能对RNA样品中的gDNA有效去除,因此对RNA质量的要求不高。TAKARA的RR047A操作方便,反转录温度为37℃,对于大多数试验来讲是满足要求的。HaiGene的D0401操作要多一个步骤,但其反转录温度是55℃(耐高温的反转录酶),提高了反转录温度使得高GC含量、复杂模板、长mRNA的模板都能有效反转录,因此其反转录效率更高,更能够获得样本中基因的真实表达量。如果后续试验是RealTime PCR、ORF克隆、高GC含量、或者你的待研究基因结构复杂程度未知,还是选用耐高温的反转录酶更理想。对于反转录高手来说,直接购买反转录酶、再购买Rnase Inhibitor自己配制反转录体系就可以了。对于样本量大的课题组来讲,相对还是比较经济的。选择反转录酶时仅需要考虑是否需要耐高温的酶,来克服目的基因的复杂结构就可以了。PROMEGA、TAKARA、HaiGene、 TRANSGEN等品牌的反转录酶性价比还都是不错的。Life、NEB的也不错,不过性价比一般,不一一解释了。
转录的只是插入的片断,怎么会跟模板一样大呢,一般情况下应该比模板小多了。我都是跑电泳,严格来说应该跑变性的;嫌麻烦可以非变性,快速(防止RNA降解)十分钟即可;抛出来的带会有两条,上面大的是模板,下面一条比较亮的是RNA,那么你的转录就 成功了。
PCR第一个步骤如果没记错的话应该叫“变性”, PCR的话是不需要解旋酶的,直接利用DNA的高温变性特性,在高温下,使氢键断开,DNA双链恢复为单链。 (还有解旋酶好像是解除双螺旋的结构,是一种拓扑异构酶,对于氢键的打开没有贡献吧
一、cDNA第二链的合成:
1. 第一链反应完成后,取2ul一链产物-20℃冰箱中保存,待电泳检测。其余的产物合并,混匀,然后顺序加入下列试剂(promega):
20ul 10×DNA Polymerase I buffer
6ul10mM dNTP(自己配制)
xuldd H2O
1ulRNase H(2U/ul)
10ul DNA Polymerase I(10U/ul)
总体系为200ul;
2. 混匀后,16℃反应2.5小时;
3. 70℃灭活10分钟;
4. 反应完成后,得到200ul cDNA第二链反应体系,将此体系置于冰上;
5.取2ul二链产物,同保存的一链产物一起电泳鉴定。同时上1kb ladder,确定双链的大小范围。
注:一链,二链的电泳图是smear,且二链稍比一链大一些。
二、双链cDNA末端补平:
1. 在第二链反应体系中,顺序加入下列试剂(promega):
6ul 10mM dNTP
2ul T4 DNA Polymerase(8.7U/ul)
2ul BSA(10mg/ml)
2. 稍微离心混匀反应物, 37℃反应至少30分钟,然后75℃灭活10分钟;
3. 加入等体积酚/氯仿/异戊醇,剧烈振荡后,常温下13000g离心5分钟;
4. 离心后,吸取上清于另一1.5ml eppendof管中,加入等体积氯仿,上下颠倒几次混匀后,常温下13000g离心5分钟;
5. 吸取上清至另一eppendof管,加入1/10V3M NaAc(PH5.2)和2.5V预冷的无水乙醇,混匀,-20℃放置过夜以沉淀双链cDNA;
6. 第二日,将昨日沉淀物在4℃,13000g离心60分钟以充分沉淀双链cDNA;
7.离心完毕,弃上清,加入1ml 70%乙醇洗涤沉淀,常温下13000g离心5分钟;
8.离心完毕,弃上清,干燥沉淀至无乙醇气味.
注:第3,第4步可以用PCR 纯化试剂盒代替。
PCR纯化试剂盒操作流程:
1.溶液PE使用前应加入适量体积95%-100%的乙醇,混匀。
2.向200ul二链补平产物中加入5倍体积的buffer PB,混匀。
3.加入spin column中,13000rpm离心1min。
4.加入0.75ml buffer PE,13000rpm离心1min。
5.13000rpm,再离心1min。
6.将spin column放入一新的离心管中,加入50ul buffer EB,静置10min。
7.13000rpm离心2min。
8.加入30ul buffer EB,静置10min。
9.13000rpm离心2min。
10.加入1/10体积3M的NaAc,2.5倍体积无水乙醇,混匀,-20℃沉淀过夜。

