Features:- magenta chromogen/red fluorescent precipitant- Fluorescent (Excitation:broad excitation spectrum, approx. 365 nm to 560 nm / Emission:Above 560 nm)- Precipitated by Alkaline Phosphatase (AP)- Suitable for non-aqueous (permanent) mounting- Sufficient reagents to produce 200 ml of working solution- For Brightfield, Darkfield, Electron, Spectral Imaging- Suitable for IHC, ICC, IF, ISH, Blotting Applications, and Elispot- No wait times for mixing and dissolving powders or tablets- Suitable for use in single or multiple labeling assays- Stock solutions in convenient dropper bottles- Heat Stable- One year expiry date- CE Mark Applications:- Immunohistochemistry- Immunocytochemistry- Immunofluorescence- In situ hybridization- Blotting Applications- ElispotDetails: Vector Red™ AP Substrate Kit produces a magenta heat stable reaction product that is also fluorescent. Sections stained with the Vector Red™ substrate can be dehydrated, cleared, and permanently mounted. This chromogen can be used singly or in combination with other alkaline phosphatase or peroxidase substrates for multiple label applications. Because of its stability under ISH conditions, Vector Red™ can be used in IHC/ISH double labeling applications. With the aid of imaging systems and software, the spectral profile of this substrate can be distinguished from other enzyme substrates in applications where antigens are co-localized.The bright red to orange fluorescence of the Vector Red™ reaction product can be visualized using Daylight® 594, Texas Red® or TRITC filter systems. This fluorescence is especially bright in dehydrated, permanently mounted sections. The fluorescence is stable and does not photobleach like most fluorescent dyes. This substrate can also be used for in situ hybridization or on blots, where it has a wider dynamic range than other substrates.
LifespanBiosciences公司是分子病理学行业的领头军，销售抗体、免疫组化服务以及蛋白质定位数据库。1995年创立的LifeSpanBiosciences已开发了针对药物标靶主要种类的专有抗体，用以研究这些蛋白质在人正常和患病组织中的表达。LifeSpanBiosciences在高通量成像和癌症鉴别软件产品中也处于领先地位，正在开发用于在在临诊前期毒理学和癌症诊断方面进行病理学解读的仪器和软件。
关于LifeSpanBioSciences，Inc.（LSBIo）LifeSpanBioSciences为全球研究人员提供高质量的抗体，蛋白质，生化试剂，ELISA和化验试剂盒，免疫组化数据和服务。由Drs。于1995年创立。约瑟夫·布朗和格兰纳·伯默（LSG）成立于LSBio，是一家分子病理学公司，致力于IHC在人体疾病组织中的蛋白质定位。通过执行数千项IHC研究以及生成和测试成千上万种抗体获得的经验，LSBio已成为抗体行业的世界领导者，并以卓越的声誉而著称。 LSBio拥有针对20,000个靶标的550,000单克隆和多克隆抗体目录。抗体可用于大多数物种和所有主要研究应用，例如免疫印迹，IHC，免疫荧光和荧光激活的细胞分选。通过广泛的正在进行的内部测试，这些抗体中的14,000多种也被鉴定为特殊的IHC试剂，并获得了IHC-plus™品牌。 LSBio还提供30,000种高质量的免疫测定，包括夹心ELISA（酶联免疫吸附测定）试剂盒，竞争性EIA（酶免疫测定）试剂盒以及基于细胞和DNA结合的试剂盒。 LSBio还提供45,000种天然蛋白提取物以及经过工程改造的重组蛋白，其形式为细胞裂解液或高度纯化的试剂。 最近，LSBio发布了他们不断增长的化验试剂盒和生化试剂系列，旨在补充研究社区的其他产品线。 十多年来，研究人员一直依靠LSBio的专业知识来满足其分子病理学外包需求。LSBio的服务包括：抗体生产和鉴定，定制的IHC研究（由庞大的档案人类组织库支持）以及组织交叉反应性筛选。 LSBio坚持其产品和服务的质量，并提供无与伦比的客户服务和支持。在未来的几年中，LSBio计划继续扩大其高质量蛋白质组学产品的目录，为客户提供出色的试剂，服务和支持，以加速他们的研究。
免疫组织化学服务与LifeSpan合作设计定制的免疫组织化学，以解决您的特定生物学问题。将整个定位过程外包，而不必担心寻找和表征靶标特异性抗体，寻找和鉴定难以发现的组织，并具有解释与复杂的人类病理学有关的免疫染色的能力。TCR筛选服务在免疫组织化学中针对大量正常的冷冻人类组织类型测试您的治疗性抗体，以确定潜在的意外结合。我们的非GLPTCR服务是根据FDA的建议设计的，该建议在其“用于人类的单克隆抗体产品的生产和测试要考虑的要点”中概述。免疫组织化学验证抗体的领导者新冠肺炎LSBio提供了许多与冠状病毒有关的产品，包括抗体，蛋白质，检测试剂盒和可表达的ORF克隆。SARS-CoV-2/COVID-19冠状病毒检测冠状病毒和COVID-19抑制剂冠状病毒蛋白质组学细胞因子释放综合征一般冠状病毒信息抗体我们收集了针对大多数靶蛋白的565,268单克隆和多克隆抗体。它们涵盖了所有主要的研究物种，应用，并且有多种共轭形式。我们的IHC-plus™抗体非常适合用于FFPE人体组织免疫组织化学。所有抗体Path- Plus ™癌症病理抗体Path- Plus ™神经抗体原发性抗体Path- Plus ™癌症抗体二抗IHC- Plus ™抗体同型对照ELISA和测定试剂盒我们的传统三明治，竞争性EIA和直接ELISA试剂盒提供了一种定量测量数千个目标靶标的方法，而我们的基于细胞和DNA结合的ELISA试剂盒是进行体外研究和转录因子分析的理想选择。化学发光CLIA试剂盒可对低拷贝靶标进行高灵敏度检测，我们的开发试剂盒使研究人员能够经济高效地进行大量测定。我们不断增加的化验试剂盒集合为研究人员提供了监测多种生物过程的方法，例如细胞凋亡，细胞增殖，新陈代谢等。所有套件检测试剂盒传统ELISA试剂盒基于细胞的ELISA试剂盒磷酸特异性ELISA试剂盒DNA结合ELISA试剂盒ELISA开发试剂盒化学发光CLIA试剂盒蛋白质类蛋白质可用于各种各样的应用中，例如用于功能测定的开发，小分子筛选，原位受体活化或仅用作WesternBlot的对照。我们提供提取的天然蛋白和重组蛋白，其形式为细胞裂解物，或者从细菌或哺乳动物表达系统中纯化。许多蛋白质具有生物活性并经过认证的低内毒素。所有蛋白质重组蛋白天然蛋白质过表达裂解物生物活性蛋白无动物蛋白合成肽细胞和组织产品LSBio提供广泛的细胞和组织产品，包括FFPE组织切片，面板和阵列，第一链CDNA，基因组DNA，总RNA，细胞和组织裂解物，以及各种相关的测定试剂盒。所有细胞和组织产品组织切片和阵列细胞和组织裂解液RNA和DNA提取物分子生物学LSBio提供了超过13,000个cDNA的广泛选择，每个cDNA均可在克隆载体或十四种不同的即用型表达载体之一中获得。cDNA/ORF克隆是研究蛋白质功能和基因表达的基础。经过验证的表达就绪ORF克隆为研究人员提供了直接启动蛋白质分析和表达研究的选择，而无需花费宝贵的时间进行RNA分离，cDNA合成，框内克隆和测序。所有分子生物学产品cDNA克隆表达就绪的ORF克隆免疫组化试剂LSBio提供设计和执行定制免疫组织化学实验所需的所有组件，从抗原回收到盖玻片。用于AP或HRP底物开发的高质量，值得信赖的品牌封闭剂，检测柱和Avidin-Biotin系统。使用我们的鼠标鼠标和多路检测系统，轻松完成具有挑战性的项目。所有IHC试剂抗原提取封闭剂检测聚合物ABC检测试剂盒基材特别/柜台污渍安装介质免疫组织化学数据和服务在过去的20年中，我们进行了1000项自定义IHC研究。我们的病理学家团队在设计有效的IHC研究和解释与正常和疾病过程相关的结果方面经验丰富。这些服务得到了我们庞大的组织库的支持，该组织库几乎包含每种组织类型和疾病。定制免疫组织化学研究组织交叉反应筛选免疫组织化学报告IHC-plus™抗体关于我们的组织银行生化产品特色产品类别包括激动剂，拮抗剂，抑制剂和调节剂，可满足您的生物医学研究需求。高质量的产品可用于癌症研究，心血管疾病，细胞生物学，脂质研究，免疫学，新陈代谢，神经科学，氧化损伤和毒理学。所有生化试剂
ebiomall.com
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
步骤：1，RNA抽提（同RT）
2，逆转录，使用合成的oligo
3，p内参
4，使用根据已知序列设计的上游引物和提供下游引物做PCR，注意设计上游引物是退火温度与下游引物相差不大。
5，产物切胶回收，TA克隆测序
这个oligo和下游引物是我根据Takara和BD公司的manual自己设计的，经过我的使用效果很好。具体操作参照takara的3－racemanual。你先做3－race，了解熟悉下，成功后再做5－race。5－race要买试剂盒做，较为复杂！
cDNA完整序列的获得对基因结构、蛋白质表达、基因功能的研究至关重要。
完整的cDNA 序列可以通过文库的筛选和末端克隆技术获得。
末端克隆技术是20世纪80年代发展起来的。RACE(rapid-amplification of cDNA ends)是通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术。
RACE的优点
与筛库法相比较，有许多方面的优点
1）此方法是通过PCR技术实现的，无须建立cDNA文库，可以在很短的时间内获得有利用价值的信息。
2）节约了实验所花费的经费和时间。
3）只要引物设计正确，在初级产物的基础上可以获得大量的感兴趣基因的全长。
实验室现有的RACE试剂盒的简介
RACE是一种从一个相同的cDNA模板进行5‘和3‘末端快速克隆的方法。此方法会产生较少的错误条带。此过程中使用的酶混合物非常适合长链PCR。
使用此方法的要求是必须知道至少23－28个核苷酸序列信息，以此来设计5’末端和3‘末端RACE反应的基因特异性引物（GSPs）。
RACE引物的设计：
基因特异性引物（GSPs）应该是：
23－28nt
50－70％GC
Tm值≥65度，Tm值≥70度可以获得好的结果
需要实验者根据已有的基因序列设计5‘和3‘RACE反应的基因特异性引物（GSP1和GSP2).由于两个引物的存在，PCR的产物是特异性的。
反应中涉及到的一些事项
cDNA的合成起始于polyA RNA。如果使用其它的基因组DNA或总RNA，背景会很高。
RACE PCR的效率还取决于总的mRNA中目的mRNA的量和不同的引物有不同的退火和延伸温度。
在进行5‘和3’RACE PCR的时候应该使用热启动。
表4中给出了所有引物的相互关系。重叠引物的设计会对全长的产生有帮助。另外，重叠的引物可以为PCR反应提供一个对照。并不是绝对的要利用设计的引物产生重叠片段。
引物GSP中的GC含量要在50－70％之间。这样可以使用降落PCR。避免使用自身互补性的引物序列，否则会产生回折和
如果要用重叠片段来检测设计的引物，GSp1和GSp2之间至少是100－200碱基。只有这样才可以用扩增的产物来鉴定设计的引物是否正确。
降落PCR可以明显的增加RACE PCR产物的特异性。在最开始的循环中，退火温度高于AP1引物的Tm值，可以增加对特异性条带的扩增。随后的退火和延伸的温度降回到AP1的温度，可以进行随后的PCR循环。
形成分子内氢键。另外，避免使用与AP1互补的引物，尤其是在3‘末端。
验证基因特异性引物的对照：
单个引物的阴性对照：只用一个引物GSP来进行阴性对照。这样不应该产生任何的条带。如果可以看到明显的产物，应该改变循环的参数，或重新设计原始引物。
利用两个GSPS进行阳性对照：（只有两个GSP可以产生重叠的时候才可以采用此步。）为了确定RNA样品中目的基因确实表达，利用两个GSP和接头连接的cDNA来产生阳性对照。可以产生两个引物之间的重叠大小的片段。如果没有这个片段，应该重复cDNA的合成，或者从一个不同的组织或细胞来源进行cDNA的合成。
制备和抽提polyA RNA
不要使用DEPC处理过的水。
纯化完mRNA之后，利用琼脂糖凝胶电泳检测mRNA的质量。哺乳动物的mRNA样品是0.5－12kb的拖带，在其中有4.5和1.9kb的rRNA的条带。非哺乳动物的mRNA应略小。
具体的实验步骤
cDNA第一条链的合成：
我们建议进行cDNA合成的对照反应，这样可以对样品的cDNA的合成进行鉴定。加入各种试剂之后，在气浴中42度保温一个小时。
注意： 在水浴或酒精浴中保温回减少反应体积，从而降低第一链的合成效率。
将管放于冰上，以终止第一链的合成反应。
直接进行第二链的合成。
cDNA第二链的合成：
第二链合成的酶混合物中，含有聚合酶、RNaseH和连接酶。T4 DNA聚合酶的功能是补平dscDNA的末端。我们建议做阳性对照，试剂盒中提供人类骨骼肌的mRNA。
建议进行阳性对照,cDNA的质量取决于制备的polyA RNA的质量。非哺乳动物样品的mRNA大约在0.5－3kb之间。
通过电泳检测cDNA的产量，与对照进行对比，这样可以有利于在以后的步骤中对cDNA进行稀释。
接头的连接及连接产物的稀释
按照程序进行连接反应。
如果没有对比样品和对照的产量，利用Tricine－EDTA buffer制备接头连接的ds cDNA的1/50和1/250的稀释物，用两种稀释物进行以下的RACE PCR反应，直到鉴定出哪一种稀释可以得到好的效果。
RACE－PCR扩增
进行5’和3’的RACE－PCR扩增。
利用以下的程序进行降落PCR反应：
注意：
我们建议使用降落PCR反应，这就要求GSP的Tm值≥70度。
当循环结束时，利用1.2%琼脂糖凝胶电泳分析每一个管中的产物5μl，使用适当的分子量marker。
可以根据你的基因的特异性来设计最理想的循环参数。如果看不到带或者只有微弱的带，在68度多加5个循环。最佳的延伸时间取决于扩增条带的长度。如果片断的长度在2－5kb的时候，经常使用4min，0.2-2kb的时候将延伸时间减到2－3min，对于5－10kb的条带，延伸时间增加到10min。
RACE产物的验证：
应该对RACE的片段进行验证,以此来确定是否已经扩增了理想的产物。如果得到的是多条带或者研究的是多基因家族的成员，验证是非常有用的。
有3种验证RACE产物的方法：
（1）比较由GSP和NGSP获得RACE产物。
（2）Southern blot
（3）克隆并测序
我们建议最好测得RACE产物的部分序列。有的时候需要嵌套引物的存在。
比较由GSP和NGSP获得RACE产物
对于5‘末端的RACE产物，比较由AP1和GSP1扩增出来的产物和由AP1和NGSP1扩增出来的产物。
对于3‘末端的RACE产物，比较由AP1和GSP2扩增出来的产物和由AP1和NGSP2扩增出来的产物。这对于鉴定多条带是否是上一个PCR的特异性产物是非常有用的。
如果条带是正确的，在嵌套PCR反应中的条带应该是略微小一些。基本PCR和嵌套PCR产物的迁移率的不同取决于cDNA结构中GSP1和嵌套引物的位置。
RACE产物的克隆和测序：
可以利用胶回收试剂盒来回收RACE产物，此试剂盒适合回收2.5kb以下的RACE产物；对于长的片段，可以通过电洗脱获得好的结果。如果你选择使用其他的纯化方法，最后用Tricine－EDTA buffer 30μl重新悬浮DNA样品。
电泳5μl回收的样品来鉴定回收的质量。
将回收的PCR产物直接克隆到/A型的PCR克隆载体中。另外还可以利用接头和/或cDNA合成引物中的Not1、Srf1、Xma1、ECOR1等酶切位点，将产物克隆到常规载体中.
对于5‘端的RACE产物，我们建议挑取至少8－10个不同的克隆以获得5‘端的最大可能性的序列。（反转录并不总是进行到mRNA模板的5’末端，尤其是长模板。另外，T4 DNA聚合酶会移走5‘末端的0－20个碱基。）
一旦鉴定了含有插入片断的克隆，应该获得多的序列信息。理想的是，可以对整个开放读码框进行测序。包括5‘和3‘的非翻译区。
全长cDNA的获得
通过部分或全部测序鉴定了RACE产物后，可以通过两种选择获得全长的cDNA。
通过PCR的方法获得全长cDNA：
扩增长的cDNA需要较长的延伸时间，但是如果延伸的时间过长，可以产生拖带，所以要慎重的设计引物。
根据从5‘和3‘RACE产物获得序列信息设计5’和3‘GSP引物。这些引物应该来自cDNA的3’或者5‘的末端，应该是23－28nt长。不应该在引物的末端加上限制性位点，这样会导致高背景。在某些时候可以设计3’和5‘的嵌套引物。但是还是应该先利用一对引物进行PCR反应。
进行如下的热循环：
94度 30秒
25个循环 94度 5秒
72度 2－15分钟
延伸的时间应该等于预期的cDNA长度加上2分钟。例如：预期得到6kb的条带，用6＋2＝8分钟的延伸时间。
注意：如果没有条带或者条带弱，增加5个循环；或者优化PCR的条件。
在1.2%的琼脂糖凝胶上分析5μl的样品。通常情况下，可以见到一条单一带，如果这样，利用胶来纯化全长的cDNA。
制备1.2%的TAE buffer制备琼脂糖凝胶。不使用TBE buffer，TBE的胶很难制备全长的cDNA。
将剩下的45μl反应物点样，选用适当的marker。
利用长波紫外观察cDNA（≥300nm）切下全长的cDNA。注意：应该尽量减少紫外对cDNA的照射。
利用胶回收试剂盒回收cDNA。此试剂盒适合回收2.5kb以下的RACE产物；对于长的片段，可以通过电洗脱获得好的结果。如果你选择使用其他的纯化方法，最后用Tricine－EDTA buffer 30μl重新悬浮DNA样品。
将全长的cDNA克隆到T/A型的 PCR克隆载体中。
Clontech的非常好, 感觉. 效果不好可能是RNA问题, 或RTase的问题. 因为目前clontech的RTase是Takara的产品，而非原来clontech的产品，可单购。
求采纳
RACE是基于PCR技术基础上由已知的一段cDNA片段，通过往两端延伸扩增从而获得完整的3'端和5'端的方法
RACE技术的原理和操作方法：http://wenku.baidu.com/link?url=J-9lPSGmRLQriSfXhOqcYYFvJx7ktGIRMgU6k9vDQIywtdJ8deNg7Qi5t4CgtjxuhWUBvQO6_qsULiqUIFckEZty75jYNw5yz6rNqiIKCwm
