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刚开始接触荧光定量－PCR，有很多问题不是很明白，脑子比较乱，我做了RT-PCR检测一目的基因表达，扩增产物清晰，明确，其长度与Marker对照相吻合，老板叫我对其测序，然后在进行荧光定量检测。
⑴测序是为了验证扩增产物是否为自己的目的产物，既然我的产物长度符合要求，那么有必要进行测序吗？②对于荧光定量检测，我先前的那对引物可以接着用吗？③如用ABI7700采用Taqman探针法检测，探针的设计是自行用软件（如primer5.0）或参考文献提交公司合成（像PCR引物合成）那样吗？④看到有的文章介绍，探针是国外的、国内的，这是什么意思？依我的理解：就像PCR引物合成，只要合成正确，荧光标记完好，国外国内不都一样吗？⑤看到有相应试剂盒提供，其提供的东西有哪几样？是不是探针，引物都包括了，对于那些常见的基因都有相应的试剂盒卖吧，关键是价钱贵吗？
看到一个同事做一课题就是设计荧光定量PCR检测某产物，结果半年也没搞出来，令我感到很生畏。现在还有很多临床病原微生物的荧光定量检测还未成功，有的还需优化，是不是设计较困难，哎呀，还未做，就感到力不从心了，大家帮帮我

不清楚这个易瑞什么来路，目前的基因检测主要有2类，一类是通过SNP位点（基本上是以SNP芯片为手段，也有针对单基因或少数几个基因位点的使用的是PCR加测序或分型的方式），还有一类是对全基因组进行测序，一般目前采用的是Hiseq X-ten测序。
价格上第一种如果是几百万个SNP位点的一般是1000元左右，如果是单基因或少数几个基因的也就几十块钱。第二种全基因组测序的一般测序深度30X以上，90G左右数据，测序费用大概在8000左右，分析snp和Indel的变异费用在1000左右。
但是，目前完全不建议做。因为SNP的变异与疾病和表型的研究完全不够充分。单基因的遗传疾病根本不用测序自己就看出来了，多基因的复杂疾病基因遗传因素所占比例有限，只是一个相关概率问题，而且即便知道了也没什么手段，早点拿到的数据也是一堆ATCG和SNP变异和所谓风险值。
还有测序和数据分析费用在飞速下降，目前上万的全基因组测序同样的数据可能1年后只用几百块，真正有效的解读也还要等到几年后，没必要花这个冤枉钱。
但是以下人群有这个切实需要：肿瘤的突变分型（目前并没有特别靠谱的高通量测序产品，主要还是基于荧光定量PCR的检测试剂盒），新生儿的遗传病筛查（看个人接受程度）

miRNA第一链合成试剂盒miRNA荧光定量PCR检测试剂盒2 x miRNA Loading Dye你看看 提供技术支持本数据来源于百度地图，最终结果以百度地图最新数据为准。

荧光定量pcr是检测hpv病毒的一种方法，检查是否感染了hpv病毒。tct是筛查宫颈癌的。

请问有没有必要常规进行HPV检测，如果要检测，用那种试剂盒比较好呢？

人巨细胞病毒核酸检测试剂盒符合哪些国家标准
:探讨人巨细胞病毒(HCMV)核酸定量检测试剂(PCR‐荧光探针法)的临床使用及初步评价。

ABI公司的SYBRGreenPCRMasterMix试剂盒，现货，PartNo:4309155,LotNo:0501170。如果有需要的可以跟我联系：Tel：13601030286Email：lantianxiangyan@yahoo.com.cn

前一段时间在百度中搜索，发现多年前写的一个关于荧光定量PCR技术的PPT有很多人看过或引用过，考虑到自己作荧光定量PCR工作已经了五年了，做的实验以及解决的问题远比五年前多了，因此利用过年的时间，写点荧光定量PCR实验中的一些注意事项及感想，无论对错，都是希望对相关的人员有些参考价值。
荧光定量PCR原理等大家都已经很熟了，我就不细说了，主要是写一些有人问过的事，希望写的内容是大家都关心的。

普通PCR与荧光定量PCR技术区别？
简单的讲PCR技术最早是用于扩增一段特异的PCR片段，用于克隆、测序等实验，后来也将其用于样本中特异的PCR片段有无或非很粗的相对定量，而荧光定量PCR技术则是为了测定样本中特异的PCR片段相对及绝对量，是一种测定特异的PCR片段含量的方式。如测定病人样本中病原体的含量、实验样本中某一特定的mRNA的含量等。
前些年有人讲过普通PCR后，通过电泳也可以进行定量，其实是将PCR产物的定量与PCR样本中模板定量相混了。近两年没有人再讲这类的话了。

SybrGreen、Taqman、Molecularbeacon、LUX这些方法如何选择？
从实验成本来讲，SybrGreen是最好的，基本上就是普通PCR加上一点SybrGreenI荧光染料即可，其信号强度也很好，还可以进行融解曲线分析等，但缺点是只能在一个反应管内进行一种PCR反应的检测，另一个问题是非特异性扩增会影响实验结果，当然也有一些技术解决这些问题，后面会讲到。对于研究人员来讲，如果需要检测的基因很多，而每个反应管中进行一种PCR反应的检测可以满足实验要求，则SybrGreen是最好的选择。

如果需要进行多通道实验，即在一个反应管中进行2种或以上的反应，则要选择其他的方法，最常用的是Taqman、Molecularbeacon，这两种都是探针的方式，由于增加了探针的特异性，因此其扩增曲线反映的就是特异性产物的扩增曲线，不含有非特异性扩增的成分。因此商业用途的检测试剂盒大都采用这一技术，以减少非特异性产物造成错误结论的可能性。其缺点在于探针成本较高，有时设计的探针并不合适，有造成损失的可能性。并且要进行较多的实验条件的优化。这两种探针技术用于商业目的时都有专利问题，据说取得Molecularbeacon的许可权的成本相对较低，但只是据说。

另一种值得一提的是LUX探针，它也可进行多通道实验，但它没有Taqman和Molecularbeacon方法的增加探针特异性的功能，因此只能是一种折中的方案，如果不考虑多通道实验，则不如SybrGreen法

选择单通道实验还是多通道实验？
这是要根据实验需要来选择的，如果有一个、两个或是三个基因要进行比较，并用看家基因进行对照，可以考虑选择多通道实验。多通道实验的好处是可以消除样本加样的误差。但要克服的困难也比较多，一是条件的优化比较麻烦，即多种PCR反应以及探针要在同一个反应条件下进行，并且效率都要比较高，另一个困难是要求相互之间没有干扰，因为干扰会影响到实验结果。还有一个困难是当一个基因的模板数显著大于其他基因时，因为共用核苷酸等资源的原因，会让模板数少的基因的定量值变小或变为零。因此一般两通道的实验比较多些，即一个基因进行多样本比较，用看家基因进行对照。

可以看出，如果单通道实验可以解决问题，就不要选择多通道实验了。三个以上的基因进行比较时就最好用单通道。因为一般的仪器最多也只有四个通道，就是有更多的通道，实验条件的优化也是足够麻烦了。

双通道实验时如何克服反应条件、干扰以及模板数差别很大等困难？
对于反应条件的优化，可通过两个单独实验的标准曲线来优化，主要是复性温度，可用PCR仪的温度梯度功能来选择，然后找到一个合适的复性温度。对于如何确定是否存在相互干扰，则要通过两个独立的单通道实验与双通道实验的结果进行比较，如果差别不大，则表明没有干扰。至于模板数差别很大的问题，可以通过降低引物浓度的方法来实现，即primerlimited，在一般的PCR反应中，引物的浓度是足够高的，基本上可以将反应液中的核苷酸全部消耗尽，在优化引物浓度时，用不同的引物浓度进行实验，找到不影响反应的C(t)值的最低引物浓度。这样在实际反应中，模板数高的基因在引物耗尽后，反应液中仍然有足够的核苷酸等用于另一个基因的反应。

引物设计中的几个注意事项
1、引物设计最好用相关的软件来进行设计，考虑引物自身回折、错配、引物二聚体、复性温度、产物变性温度等问题，其中产物的变性温度是大家不太关心的问题，但有些产物在一般的95度条件下不能充分解链，会严重影响实验结果。
2、引物所设计的片断一定要有足够的特异性，选择好片段后，最好到互联网中进行相关的搜索，看在样本的基因组有没有相拟的基因以及假基因等，如果有，则可选择特异性更高的区域。
3、在进行mRNA表达量的定量，可以在引物设计时考虑基因组的污染问题，即在引物设计时让两个引物跨一个内含子，这样基因组污染所造成的扩增可以区别出来，或因为片段过大而不能扩增
4、由于mRNA表达量的定量有一个逆转录的过程，如果逆转录是用poly（T）作引物，则设计的片段尽量靠近poly（A），以免逆转录的效率影响到实验结果。如果用特异性引物进行逆转录，则要考虑引物区是否存在RNA二级结构的问题
5、产物片段的大小：定量PCR一般产生片段都不大，不会超过600bp。SybrGreen法一般选择250-600bp，过大会影响到PCR扩增的效率，过小则很难通过融解曲线与引物二聚体分开，但并不是绝对的。Taqman法的扩增片段都很小，几十或是100多，这是其原理造成的。Molecularbeacon法对片段大小的要求不高，只要不是太长即可。

SybrGreen法的实验策略：
实验可分为三个阶段，即实验条件的优化、预实验和正式实验。
一、实验条件的优化阶段，这一阶段是最花时间的，
1、要找到一个阳性的模板，可以是克隆有基因质粒、强阳性样本或纯化的PCR产物等。有了阳性的模板才能进行最基本的定量扩增实验，如果有普通PCR的实验条件，也可以此为基础进行实验。
2、扩增出的产物要通过电泳方法确定其大小，以确认定量PCR扩增的产物是你的目的基因，有些用户就发生过优化了几天的条件才发现扩增片段的大小不对，不是自己想要的基因。当然，能测个序什么的最好。并通过融解曲线实验来确定产生的Tm值以及所用的变性温度是否已经足够，个别情况下会出来解键不充分的现象。
3、有了基本的PCR条件后，要将阳性模板进行倍比稀释，一般用10倍稀释。将稀释的模板带上阴性对照，分成多份进行温度梯度实验，对复性温度进行优化，以找出复性温度范围，复性温度最好能满足以下条件：高中低模板浓度下PCR扩增效率都很高、阴性模板没有扩增。选择满足条件的中间温度，这样可以提高实验的稳定性，不会因为样本管在加热模块中的位置不同而影响实验结果。
4、如果找不到合适的条件，如引物二聚体过多，可对引物浓度、Mg2+离子浓度、DMSO含量等进行优化，然后再进行复性温度梯度实验。其中Mg2+离子浓度、DMSO含量都会影响Tm值以及所用的变性温度。

二、预实验阶段
按照优化的条件对所需要分析的样本做一个没有重复的实验，每个样本做一个10倍和100倍稀释的实验，预实验的目的主要有两个，一是了解样本的模板浓度范围，如果有样本的模板浓度在标准曲线之外，如过高或过低，则可能要对标准曲线进行重新优化，当然，如果过高和过低不影响你的实验结论则可定为高于多少或低于多少，直接进行外推是不科学的。另一个目的看样本中是否有PCR抑制物的影响，如果每个样本的定量结果与其10及100倍稀释后的样本的结果相同，则表明没有抑制物的影响，如果不同，如原倍结果为零，而10及100倍稀释后的样本的结果为阳性，则表明样本中PCR抑制物浓度较高。可用其10及100倍稀释后的样本进行定量。
有几个用户发现过实验为阴性的样本在其10及100倍稀释后的样本为阳性的，也许有更多用户没有进行这样的实验，得到了错误的结论。因为样本RNA的提取试剂中经常有抑制PCR反应的物质，清洗不干净就会影响到定量PCR反应。

三、正式实验阶段
然后就可以进行正式实验了，只需要将每个样本作三个或更多的重复即可以了。有抑制物的样本先进行稀释，计算浓度时不要忘记就行了。最后就可以进行实验结果分析了，个别样本中离群的数值可以删除。

SybrGreen法的注意事项
1、最好按照上面提到策略进行实验，以免造成不必要重复实验，从而降低实验成本
2、SybrGreenI一般是先将母液用DMSO进行稀释100倍，最终的使用浓度为4000-10000分之一。可能不同的SybrGreenI母液的稀释倍数不同，可通过实验来证明，但高浓度的SybrGreenI肯定会影响PCR反应。另外用水稀释后的SybrGreenI保存的时间很短，一般1周后就不能用了。DMSO似乎反复冻融会影响性能，但原因不明。
3、在对引物浓度、Mg2+离子浓度、DMSO含量等进行优化后仍得不到满意的结果，特别是引物二聚体很多时，可以考虑更换引物，因为引物成本低，而优化实验成本很高。
4、当有少量引物二聚体影响荧光结果时，可以提高荧光读板时的温度来消除引物二聚体的影响，如将读板时的温度提高到82度，此时引物二聚体已经解链而产物没有解链。但引物二聚体浓度很高时会严重影响PCR反应，消除引物二聚体的影响也没有用。
5、大家都知道进行绝对定量需要标准曲线，有些用户认为进行相对定量时就不需要标准曲线了，可以通过2ΔΔC（t）来计算，但这一计算是有条件的，即所有荧光定量PCR扩增的效率都接近于100%，可以通过实验来证明。但大多数用户并没有进行这样的实验就直接用2ΔΔC（t）来计算了。这是错误的，会得到错误结论。
6、无论是使用自配的试剂还是用商业的荧光定量试剂盒，最好买够试剂，以免进行预实验或正式实验时没有试剂而必需采用其他试剂，由于不同试剂的缓冲液成份有较大差别，如有的试剂中含有DMSO及Mg2+离子等，可能会影响到实验结果，甚至要重新进行实验条件的优化。
7、不要在管盖上写字，原因很明显，但有些用户习惯了写字，后来再擦掉，也会对实验有些影响。
8、最好使用高质量的PCR管，低质量管的管间差可能会很大。
9、每次实验一定要有阳性对照和阴性对照，以免出现问题时找不到原因。
10、在样本很珍贵时可以采用对样本进行稀释的方式进行定量。只要浓度不是太低，理论来讲对稀释是不会影响实验结果的。

其他方法也可以采用类拟的策略，以节约成本，提高效率。

想到的内容就这些了，希望大家多批评指正。



反应体系的建立及优化
来源：作者：发布时间：2008-10-17
1.SG浓度：
　　终浓度1:5,000－1:100,000，一般为1:10,000—1:70,000

2.Primer浓度：
　　终浓度50nM－300nM
　　固定摸板浓度的梯度实验
　　不加摸板的对照实验（NTC）——有无非特异信号
　　熔解曲线的分析——是否单峰
　　建议使用HPLC纯化的引物

3.MgCl2浓度
　　降低MgCl2浓度以减少非特异性产物
　　最低可至1.5nM
　　同时做梯度实验和NTC对照

4.反应温度和时间参数
　　反应温度参考所用酶的种类
　　退火温度使用温度梯度功能优化
　　反应时间与常规PCR类似，扩增片断一般为200－300bp

5.TaqMan探针
　　引物、探针设计：
　　首先选择探针序列
　　探针的Tm值为68－70度，长度不应超过30碱基
　　探针的5’端不应是G，G有可能会淬灭荧光素
　　引物应尽量靠近探针，扩增片断不超过400bp，通常为80－150bp
　　引物的Tm值为59－60度，长度约20碱基
　　避免引物、探针之间的二级结构

委托合成公司设计
　　使用辅助软件
　　确定反应参数
　　一般为两步法，94度10－20s
　　60度30－60s（Taq酶的5’外切酶活性在60度最强）
　　通过温度梯度优化退火温度
　　三步法，72度45s
　　优化引物探针浓度

目标：最高的信号/背景比
　　最小的Ct值
　　引物浓度：50nM-900nM
　　探针浓度：50nM-250nM
　　通过多次实验确定各自的浓度和比例

博陵科为 的 miRcute miRNA荧光定量检测试剂盒（SYBR Green），可检测pg级总RNA中miRNA的单碱基差异
　　miRcute miRNA荧光定量检测试剂盒（ SYBR Green）中包含miRNA荧光定量检测的所有试剂，包括2×miRcute miRNA premix和Reverse primer.2×miRcute miRNA premix是专门为miRNA检测而研发的新一代荧光定量检测试剂，该检测试剂采用premix预混系统，包含了优化配比的dNTP、增强 剂、稳定剂等，且其中的DNA polymerase采用的是新一代抗体修饰的热启动技术，保证高特异性和高灵敏度。同时，还加入了 ROX作为内参染料，以使实时荧光定量PCR结果准确可靠。
　　产品特点
　　■ 通量高：可用于从一个合成反应的cDNA中 检测多种miRNAs.
　　■ 特异性：性能优良的抗体热启动PCR聚合酶技术及其优化的反应体系避免了非特异性扩增。
　　■ 分辨率高：能分辨单碱基差异的miRNA.
　　■ 灵敏度高：可在低至pg级的总RNA中检测到特异表达的miRNA.
　　适用范围
　　■ 对miRNA反转录后的cDNA进行荧光定量 PCR检测
　　■ 适用于各种类型荧光定量PCR仪
　　保存条件：4℃避光保存，避免冻结。

荧光定量PCR原理等大家都已经很熟了，我就不细说了，主要是写一些有人问过的事，希望写的内容是大家都关心的。

普通PCR与荧光定量PCR技术区别？

简单的讲PCR技术最早是用于扩增一段特异的PCR片段，用于克隆、测序等实验，后来也将其用于样本中特异的PCR片段有无或非很粗的相对定量，而荧光定量PCR技术则是为了测定样本中特异的PCR片段相对及绝对量，是一种测定特异的PCR片段含量的方式。如测定病人样本中病原体的含量、实验样本中某一特定的mRNA的含量等。

前些年有人讲过普通PCR后，通过电泳也可以进行定量，其实是将PCR产物的定量与PCR样本中模板定量相混了。近两年没有人再讲这类的话了。

SybrGreen、Taqman、Molecularbeacon、LUX这些方法如何选择？

从实验成本来讲，SybrGreen是最好的，基本上就是普通PCR加上一点SybrGreenI荧光染料即可，其信号强度也很好，还可以进行融解曲线分析等，但缺点是只能在一个反应管内进行一种PCR反应的检测，另一个问题是非特异性扩增会影响实验结果，当然也有一些技术解决这些问题，后面会讲到。对于研究人员来讲，如果需要检测的基因很多，而每个反应管中进行一种PCR反应的检测可以满足实验要求，则SybrGreen是最好的选择。

如果需要进行多通道实验，即在一个反应管中进行2种或以上的反应，则要选择其他的方法，最常用的是Taqman、Molecularbeacon，这两种都是探针的方式，由于增加了探针的特异性，因此其扩增曲线反映的就是特异性产物的扩增曲线，不含有非特异性扩增的成分。因此商业用途的检测试剂盒大都采用这一技术，以减少非特异性产物造成错误结论的可能性。其缺点在于探针成本较高，有时设计的探针并不合适，有造成损失的可能性。并且要进行较多的实验条件的优化。这两种探针技术用于商业目的时都有专利问题，据说取得Molecularbeacon的许可权的成本相对较低，但只是据说。

另一种值得一提的是LUX探针，它也可进行多通道实验，但它没有Taqman和Molecularbeacon方法的增加探针特异性的功能，因此只能是一种折中的方案，如果不考虑多通道实验，则不如SybrGreen法.

前一段时间在百度中搜索，发现多年前写的一个关于荧光定量PCR技术的PPT有很多人看过或引用过，考虑到自己作荧光定量PCR工作已经了五年了，
做的实验以及解决的问题远比五年前多了，因此利用过年的时间，写点荧光定量PCR实验中的一些注意事项及感想，无论对错，都是希望对相关的人
员有些参考价值。
荧光定量PCR原理等大家都已经很熟了，我就不细说了，主要是写一些有人问过的事，希望写的内容是大家都关心的。
普通PCR与荧光定量PCR技术区别？
简单的讲PCR技术最早是用于扩增一段特异的PCR片段，用于克隆、测序等实验，后来也将其用于样本中特异的PCR片段有无或非很粗的相对定量，而
荧光定量PCR技术则是为了测定样本中特异的PCR片段相对及绝对量，是一种测定特异的PCR片段含量的方式。如测定病人样本中病原体的含量、实验
样本中某一特定的mRNA的含量等。
前些年有人讲过普通PCR后，通过电泳也可以进行定量，其实是将PCR产物的定量与PCR样本中模板定量相混了。近两年没有人再讲这类的话了。
SybrGreen、Taqman、Molecularbeacon、LUX这些方法如何选择？
从实验成本来讲，SybrGreen是最好的，基本上就是普通PCR加上一点SybrGreenI荧光染料即可，其信号强度也很好，还可以进行融解曲线分析等
，但缺点是只能在一个反应管内进行一种PCR反应的检测，另一个问题是非特异性扩增会影响实验结果，当然也有一些技术解决这些问题，后面会讲
到。对于研究人员来讲，如果需要检测的基因很多，而每个反应管中进行一种PCR反应的检测可以满足实验要求，则SybrGreen是最好的选择。
如果需要进行多通道实验，即在一个反应管中进行2种或以上的反应，则要选择其他的方法，最常用的是Taqman、Molecularbeacon，这两种都是探
针的方式，由于增加了探针的特异性，因此其扩增曲线反映的就是特异性产物的扩增曲线，不含有非特异性扩增的成分。因此商业用途的检测试剂盒
大都采用这一技术，以减少非特异性产物造成错误结论的可能性。其缺点在于探针成本较高，有时设计的探针并不合适，有造成损失的可能性。并且
要进行较多的实验条件的优化。这两种探针技术用于商业目的时都有专利问题，据说取得Molecularbeacon的许可权的成本相对较低，但只是据说。
另一种值得一提的是LUX探针，它也可进行多通道实验，但它没有Taqman和Molecularbeacon方法的增加探针特异性的功能，因此只能是一种折中的
方案，如果不考虑多通道实验，则不如SybrGreen法

意思是检测结果表明受检者每毫升血液中有2640000个乙肝病毒DNA。所用的检测试剂盒的检测下限是每毫升500个乙肝病毒DNA，如果受检者血液中的有乙肝病毒DNA，但是每毫升少于500个，可能就检测不出来。
定量结果显示：1.血液中有乙肝病毒DNA分子，受检者被乙肝病毒感染了；2.血液中的乙肝病毒浓度较高，积极治疗吧