class=\"container-fluid\">Supporting DataRelated ProductsProduct UsageProtocolsBackgroundPathwaysCitations & ReviewsOn Page MenuProductsPrimary AntibodiesPhospho-Stat1 (Tyr701) (D4A7) Rabbit mAbRecombinant：卓越的批次间一致性、连续供应和无动物制造。\">RRecombinant×What是一种重组抗体，为什么它很重要？

与传统抗体相比，重组抗体具有几个关键优势。这些优势包括卓越的批次间一致性、连续供应和无动物制造。因此，重组抗体正在更多地用于科学研究，特别是作为解决持续的可重复性危机的一种手段。

什么是重组抗体？

传统的多克隆抗体和单克隆抗体是正常B细胞​​发育和基因重组的产物在。它们是通过用抗原对动物进行免疫以引发免疫反应而产生的。多克隆抗体由许多不同的 B 细胞克隆分泌并识别多个抗原表位，而单克隆抗体源自单个 B 细胞克隆并且仅针对一个表位。

重组抗体是单克隆抗体，但它们的产生涉及体外遗传操作。将抗体基因克隆到表达载体中后，将其转染到合适的宿主细胞系中进行抗体表达。哺乳动物细胞系最常用于重组抗体生产，尽管细菌、酵母或昆虫来源的细胞系也适用。

出色的批次间一致性

因为重组抗体生产涉及对抗体光进行测序和重型链条，这是一个高度可控且可靠的过程。相比之下，用于生产单克隆抗体的基于杂交瘤的系统容易发生遗传漂移和不稳定ility，增加了批次间差异或抗体表达损失的可能性。重组抗体在批次之间高度一致，从而确保可重复的实验结果。

可扩展性

用于生产抗体的体外方法适合大规模生产，这意味着抗体可用性不太可能成为限制因素。此外，由于重组抗体序列已知，供应的连续性得到保证；在抗体将用于支持大型、长期研究的情况下，这可能是一个特别关键的因素。

无动物制造

与抗体生产的传统方法不同，重组方法无需使用动物。当多克隆抗体直接从免疫宿主的血清中纯化，单克隆抗体从杂交瘤来源的组织培养上清液或腹水中纯化时，重组抗体则从免疫宿主的组织培养上清液中纯化。转染的宿主细胞系。无论抗体是多克隆抗体、单克隆抗体还是重组抗体，在实验使用之前，都必须始终在预期应用中对其进行适当验证。在 CST，我们遵守 Hallmarks of Antibody Validation™，这是确定抗体在任何给定测定中的特异性、灵敏度和功能的六种互补策略。通过针对每种抗体产品仔细定制这些策略，我们保证 CST 抗体将按预期发挥作用，帮助您获得值得信赖的结果。

Phospho-Stat1 (Tyr701) (D4A7) Rabbit mAb#7649Reviews ()Citations ( 334) 过滤器：WBIPIFFChIP对未经处理或经人干扰素-α1 (hIFN-α1) #8927（10 ng/ml， 30 分钟），使用 Phospho-Stat1 (Tyr701) (D4A7) 兔单克隆抗体（上）或 Stat1 抗体 #9172（下）。显示更少显示更多 对未经处理（左）或经 hIFN-α1 处理的 HeLa 细胞进行共聚焦免疫荧光分析 #8927 ( 100 ng/mL，30 分钟；右），使用 Phospho-Stat1 (Tyr701) (D4A7) 兔单克隆抗体（绿色）和 β-微管蛋白 (9F3) 兔单克隆抗体（Alexa Fluor® 555 偶联物）#2116（红色）。显示更少显示更多 使用 Phosp 对未经处理（蓝色）或经 hIFN-α1 #8927（绿色）处理的 Jurkat 细胞进行流式细胞术分析ho-Stat1 (Tyr701) (D4A7) 兔单克隆抗体。显示较少显示更多jpg\" alt=\"Chromatin Immunoprecipitation Image 1: Phospho-Stat1 (Tyr701) (D4A7) Rabbit mAb\">对来自 HT-1080 细胞的交联染色质进行染色质免疫沉淀，HT-1080 细胞经 IFN-γ (50 ng/ml) 处理 30分钟和 Phospho-Stat1 (Tyr701) (D4A7) 兔单克隆抗体，使用 SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9003。使用 DNA Library Prep Kit for Illumina® (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 制备 DNA 文库。该图显示了跨 IRF-1 的结合，IRF-1 是 Phospho-Stat1 的已知靶基因（参见包含 ChIP-qPCR 数据的附加图）。如需其他 ChIP-seq 轨道，请下载产品数据表。显示更少显示更多 对 4 x 106 HT-1080 细胞经 IFN-γ (50 ng/ml) 处理 30 分钟和 5 μl 的交联染色质进行染色质免疫沉淀Phospho-Stat1 (Tyr701) (D4A7) Rabbit mAb，使用 SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9003。使用 DNA Library Prep Kit for Illumina® (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 制备 DNA 文库。图显示 5 号染色体（上）的结合，包括 IRF1（下），这是 Phospho-Stat1 的一个已知靶基因（参见包含 ChIP-qPCR 数据的附加图）。显示更少显示更多 进行了染色质免疫沉淀HT-1080 细胞的交联染色质经 IFN-γ (50 ng/ml) 处理 30 分钟和 Phospho-Stat1 (Tyr701) (D4A7) Rabbit mAb或使用 SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9003 的 Normal Rabbit IgG #2729。使用人 IRF-1 启动子引物、SimpleChIP® Human TAP1 Promoter Primers #5148 和 SimpleChIP® Human α Satellite Repeat Primers #4486 通过实时 PCR 对富集的 DNA 进行定量。每个样本中免疫沉淀的 DNA 量表示为相对于输入染色质总量的信号，相当于一个。显示更少显示更多图片库了解更多关于我们如何获取图像的信息 × Phospho-Stat1 (Tyr701) (D4A7) Rabbit mAb 7649 在暗模式和亮模式之间切换过滤器：WBIPIFFChIP 对未经处理或经人干扰素-α1 (hIFN-α1) #8927（10 ng/ml， 30 分钟），使用 Phospho-Stat1 (Tyr701) (D4A7) 兔单克隆抗体（上图）或 Stat1 抗体 #9172（下图）。 使用 Phospho-Stat1 (Tyr701) (D4A7) Rabbit mAb（绿色）对未经（左）或经 hIFN-α1 #8927（100 ng/mL，30 分钟；右）处理的 HeLa 细胞进行共聚焦免疫荧光分析) 和 β-微管蛋白 (9F3) 兔单克隆抗体（Alexa Fluor® 555 偶联物）#2116（红色）。 使用 Phospho-Stat1 (Tyr701) (D4A7) Rabbit mAb 对未经处理（蓝色）或经 hIFN-α1 #8927（绿色）处理的 Jurkat 细胞进行流式细胞术分析。 对来自经 IFN-γ (50 ng/ml) 处理 30 分钟的 HT-1080 细胞的交联染色质和 Phospho-Stat1 ( Tyr701) (D4A7) 兔单克隆抗体，使用 SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9003。使用 DNA Library Prep Kit for Illumina® (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 制备 DNA 文库。该图显示了跨 IRF 的结合-1，一个已知的 Phospho-Stat1 靶基因（参见包含 ChIP-qPCR 数据的附加图）。有关其他 ChIP-seq 轨道，请下载产品数据表。使用交联的染色质进行染色质免疫沉淀4 x 106 HT-1080 细胞用 IFN-γ (50 ng/ml) 和 5 μl Phospho-Stat1 (Tyr701) 处理 30 分钟 (D4A7) 兔单克隆抗体，使用 SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9003。使用 DNA Library Prep Kit for Illumina® (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 制备 DNA 文库。该图显示了跨 5 号染色体（上图）的结合，包括 IRF1（下图），这是 Phospho-Stat1 的一个已知靶基因（参见包含 ChIP-qPCR 数据的附加图）。 染色质进行免疫沉淀2729 使用 SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kit（Magnetic Beads）#9003。使用人 IRF-1 启动子引物、SimpleChIP® Human TAP1 Promoter Primers #5148 和 SimpleChIP® Human 通过实时 PCR 对富集的 DNA 进行定量α 卫星重复引物 #4486。每个样本中免疫沉淀的 DNA 量表示为相对于输入染色质总量的信号，相当于一个。购买#7649Cat。 #SizeQty.Price7649T20µl$1497649S100µl$3677649L300µl$867

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抗体保证常见问题解答技术支持--数据表--无图像有图像SDS：选择您所在的地区美国-英语欧洲-中国欧洲-荷兰欧洲-英语欧洲-法国欧洲-德国欧洲-意大利欧洲-韩国欧洲-葡萄牙欧洲-西班牙欧洲-瑞典分析证书支持数据相关产品产品使用协议背景路径引用和评论支持数据反应性H M RSENSITIVITYEndogenousMW (kDa)84, 91Source/IsotypeRabbitIgGApplication Key:WB-Western BlotIP-免疫沉淀IHC-免疫组织化学ChIP-染色质免疫沉淀C&R-CUT&RUNC&T-CUT&TagDB-Dot BloteCLIP-eCLIPIF-免疫荧光F-流式细胞术物种交叉反应键：H-HumanM-MouseR-RatHm- HamsterMk-MonkeyVir-VirusMi-MinkC-ChickenDm-D。 melanogasterX-XenopusZ-ZebrafishB-BovineDg-DogPg-PigSc-S。酿酒酵母 Ce-C. elegansHr-HorseGP-Guinea PigRab-RabbitAll-All Species ExpectedRelated ProductsConjugates

产品信息

产品使用信息

为获得最佳的 ChIP 和 ChIP-seq 结果，使用 5 μl 抗体和 10 μg每次免疫沉淀染色质（约 4 x 106 个细胞）。

此抗体已使用 SimpleChIP® 酶促染色质免疫沉淀试剂盒进行验证。

ApplicationDilutionWestern Blotting1:1000免疫沉淀1:50免疫荧光（免疫细胞化学）1:50流式细胞术（ Fixed/Permeabilized)1:200Chromatin IP1:100Chromatin IP-seq1:100StorageSupplied in 10mM HEPES 钠 (pH 7.5)、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA、50% 甘油和少于 0.02% 的叠氮化钠。储存于 –20°C。不要等分抗体。有关本产品的无载体（无 BSA 和叠氮化物）版本，请参阅产品 #88211。方案选择您的方案Western Blotting免疫沉淀免疫荧光（免疫细胞化学）流式细胞术（固定/透化）染色质 IPChromatin IP-seqPRINT

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Western Blotting Protocol

对于蛋白质印迹，将膜与稀释的一抗在 5% w/v BSA、1X TBS、0.1% Tween® 20 中于 4°C 下轻轻摇动孵育过夜.

注意：推荐的抗体稀释度请参考一抗产品网页。

A.溶液和试剂

从样品制备到检测，Western Blot 所需的试剂现在都在一个方便的试剂盒中：#12957 Western Blotting Application Solutions Kit

注意：用反渗透去离子（ RODI) 或同等等级的水。

20X 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)：(#9808) 要制备 1 L 1X PBS：将 50 ml 20X PBS 添加到 950 ml dH2O 中，混合。10X Tris 缓冲盐水 (TBS)：(#12498) 要制备 1 L 1X TBS：添加 100 ml 10X 至 900 ml dH2O，mix.1X SDS 样品缓冲液：蓝色上样包 (#7722) 或红色上样包 (#7723) 通过将 1/10 体积的 30X DTT 添加到 1 体积的 3X SDS 上样来制备新鲜的 3X 还原上样缓冲液缓冲。用 dH2O 稀释至 1X。10X Tris-甘氨酸 SDS 电泳缓冲液：(#4050) 要制备 1 L 1X 电泳缓冲液：将 100 ml 10X 电泳缓冲液添加到 900 ml dH2O 中，混合。10X Tris-甘氨酸转移缓冲液：(#12539)要制备 1 L 1X 转移缓冲液：将 100 ml 10X 转移缓冲液添加到 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O 中，混合。10X Tris Buffered Saline with Tween® 20 (TBST)：(#9997) 要制备 1 L 1X TBST：添加 100 ml 10X TBST 至 900 ml dH2O，混合。脱脂奶粉：(#9999)。封闭缓冲液：1X TBST 含 5% w/v 脱脂奶粉；对于 150 ml，将 7.5 g 脱脂奶粉添加到 150 ml 1X TBST 中并充分混合。洗涤缓冲液：(#9997) 1X TBST。牛血清白蛋白 (BSA)：(#9998)。一抗稀释缓冲液：1X TBST，含 5% BSA；对于 20 ml，将 1.0 g BSA 添加到 20 ml 1X TBST 中并充分混合。生物素化蛋白 Ladder 检测包：(#7727)。蓝色预染蛋白标记物，宽范围 (11-250 kDa)：(#59329)。印迹膜和纸：(#12369) 该方案已针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常建议孔径为 0.2 µm。与 HRP 偶联的二抗：抗兔 IgG，HRP 连接抗体 (#7074)。检测试剂：SignalFire™ ECL 试剂 (#6883)。B. Protein BlottingA general protocol for sample preparation. 通过在所需时间内添加含有调节剂的新鲜培养基来处理细胞。用 1X PBS 清洗细胞；吸出。通过添加 1X SDS 样品缓冲液（6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径板每孔 500 µl）来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移到微量离心管中。置于冰上。超声处理 10-15 秒以完成细胞裂解和剪切 DNA（至红色uce 样品粘度）。将 20 µl 样品加热至 95–100°C 5 分钟；在冰上冷却。微量离心 5 分钟。

将 20 µl 上样到 SDS-PAGE 凝胶（10 厘米 x 10 厘米）上。

注意：上样预染分子量标记（#59329，10 µl/ lane) 来验证电转移和生物素化蛋白质阶梯 (#7727, 10 µl/lane) 以确定分子量。

电转移到硝酸纤维素膜 (#12369).C.膜封闭和抗体孵育

注意：体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜；对于不同尺寸的膜，相应地调整体积。

I.膜封闭（可选） 转移后，在室温下用 25 ml TBS 洗涤硝酸纤维素膜 5 分钟。将膜在 25 ml 封闭缓冲液中室温孵育 1 小时。用 15 ml TBST 洗涤 3 次，每次 5 分钟。二。一抗孵育在 10 ml 中孵育膜和一抗（按照产品网页中推荐的适当稀释度和稀释剂）一抗稀释缓冲液在 4°C 下轻轻搅拌过夜。用 15 ml TBST 洗涤 3 次，每次 5 分钟。用抗兔 IgG、HRP 连接抗体（#7074，1:2000）和抗生物素孵育膜, HRP-linked Antibody（#7075，1:1000–1:3000），用于检测 10 ml 封闭缓冲液中的生物素化蛋白标记物，室温下轻轻搅拌 1 小时。用 15 ml TBST 洗涤 3 次，每次 5 分钟.继续检测（D 部分）.D.蛋白质检测使用说明：在 TBST 中将膜结合的 HRP（抗体偶联物）洗涤 3 次，每次 5 分钟。通过稀释一份 2X 试剂 A 和一份 2X 试剂 B（例如，用于 10毫升，加入 5 毫升试剂 A 和 5 毫升试剂 B）。充分混合。将底物与膜一起孵育 1 分钟，去除多余的溶液（膜保持湿润），用塑料包裹并暴露在 X 射线胶片上。

* 避免反复接触皮肤。

2005 年 6 月发布

2020 年 6 月修订

方案 Id：10天然蛋白质的免疫沉淀

该方案旨在对天然蛋白质进行免疫沉淀，以便通过蛋白质免疫印迹或利用蛋白 A 磁分离进行激酶活性分析。

A。溶液和试剂

注意：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

20X 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)：(#9808) 要制备 1 L 的 1X PBS，添加 50 ml 20X PBS 加入 950 ml dH2O，混合。

10X 细胞裂解缓冲液：(#9803) 要制备 10 ml 1X 细胞裂解缓冲液，将 1 ml 细胞裂解缓冲液加入 9 ml dH2O，混合。

注意：在使用前立即添加 1 mM PMSF (#8553)。

3X SDS 样品缓冲液：蓝色加载包 (#7722) 或红色加载包 (#7723) 通过添加 1/10 制备新鲜的 3X 还原加载缓冲液体积 30X DTT 至 1 体积的 3X SDS 加载缓冲液。蛋白 A 磁珠：(#73778)。磁性分离架：(#7017) 或 (#14654)。10X 激酶缓冲液（用于激酶测定）：(#9802)准备 1 ml 1X 基那se 缓冲液，将 100 µl 10X 激酶缓冲液添加到 900 µl dH2O，mix.ATP (10 mM)（用于激酶测定）：(#9804) 要制备 0.5 ml ATP (200 µM)，添加 10 µl ATP (10 mM)至 490 µl 1X 激酶缓冲液。B.准备细胞裂解物吸出培养基。通过添加含有调节剂的新鲜培养基达到所需时间来处理细胞。要在非变性条件下收获细胞，去除培养基并用冰冷的 1X PBS 冲洗细胞一次。去除 PBS 并向每个板中添加 0.5 ml 冰冷的 1X 细胞裂解缓冲液（10 cm) 并在冰上孵育 5 分钟。从板上刮下细胞并转移到微量离心管中。保持在冰上。在冰上超声处理 3 次，每次 5 秒。在 4°C 下以 14,000 x g 微量离心 10 分钟，并将上清液转移到新管中。上清液是细胞裂解物。如有必要，可将裂解物储存在 -80°C.C 下。免疫沉淀细胞裂解物预澄清（可选）

强烈推荐细胞裂解物预澄清步骤，以减少非特异性蛋白质与 Protein A 磁珠的结合。前C为测试样品和同种型对照提取足够的裂解物。

短暂涡旋储备管以重悬磁珠。

重要提示：使用前预洗 #73778 磁珠：

转移 20 μl珠浆到干净的管中。将试管置于磁力分离架上 10-15 秒。

溶液澄清后小心取出缓冲液。向磁珠沉淀中加入 500 μl 1X 细胞裂解缓冲液，短暂涡旋以清洗磁珠。将管放回磁力分离架。解决方案澄清后取出缓冲液。再次重复洗涤步骤。

将 200 μl 细胞裂解物添加到 20 μl 预洗磁珠中。

重要提示：最佳裂解物浓度将取决于目标蛋白质的表达水平。建议起始浓度在 250 μg/ml-1.0 mg/ml 之间。

在室温下旋转孵育 20 分钟。使用磁力分离架将珠子与裂解物分离，将预澄清的裂解物转移到干净的管子，然后迪清除磁珠沉淀。继续进行免疫沉淀部分。免疫沉淀

重要提示：强烈建议使用适当的同种型对照，以便在您的一抗免疫沉淀中显示特异性结合。对兔多克隆一抗使用 Normal Rabbit IgG #2729，对兔单克隆一抗使用 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900，对小鼠单克隆 IgG1 一抗使用 Mouse (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control #5415，Mouse (E5Y6Q) ) mAb IgG2a Isotype Control #61656 用于小鼠单克隆 IgG2a 一抗，Mouse (E7Q5L) mAb IgG2b Isotype Control #53484 用于小鼠单克隆 IgG2b 一抗，Mouse (E1D5H) mAb IgG3 Isotype Control #37988 用于小鼠单克隆 IgG3 一抗。同种型对照应浓度匹配并与一抗样品一起运行。

将一抗（按照产品数据表中推荐的适当稀释度）添加到 200 µl 细胞裂解物中。孵育4°C 旋转过夜。形成免疫复合物。预洗磁珠（参见细胞裂解物预清除部分，步骤 1 和 2）。将裂解物和抗体（免疫复合物）溶液转移到含有预洗磁珠沉淀的试管中。旋转孵育室温 20 分钟。使用磁力分离架沉淀珠子。用 500 μl 1X 细胞裂解缓冲液洗涤沉淀物五次。在两次洗涤之间保持在冰上。继续通过蛋白质免疫印迹或激酶活性进行分析（D 部分）。样品分析

继续执行以下一组特定步骤。

通过蛋白质免疫印迹分析用 20-40 µl 3X SDS 样品缓冲液重悬沉淀物，短暂涡旋混合，然后短暂微量离心以沉淀样品。将样品加热至 95-100°C，持续 5 分钟。使用磁力分离架沉淀珠粒。将上清液转移到新管中。上清液即为样品。通过蛋白质印迹分析样品（参见蛋白质免疫印迹实验方案）。

注意：为了尽量减少变性 IgG 重链 (~50 kDa) 引起的掩蔽，我们建议使用小鼠抗兔 IgG（轻链特异性）(D4W3E) mAb (#45262)​​ 或小鼠抗兔 IgG（构象特异性）(L27A9) mAb (#3678)（或 HRP 偶联物 #5127）。为尽量减少变性 IgG 轻链 (~25 kDa) 引起的掩蔽，我们建议使用小鼠抗兔 IgG（构象特异性）(L27A9) mAb (#3678)（或 HRP 偶联物 #5127）。

用于分析激酶测定 用 500 µl 1X 激酶缓冲液洗涤沉淀物两次。保持在冰上。将沉淀悬浮在 40 µl 1X 激酶缓冲液中，辅以 200 µM ATP 和适当的底物。在 30°C 下孵育 30 分钟。用 20 µl 3X SDS 样品缓冲液终止反应。涡旋，然后微量离心 30 秒。将含有磷酸化底物的上清液转移到另一管中。将样品加热至 95-100°C 2-5 分钟，然后以 14,000 x g 微量离心 1 分钟。加载样品 (15-30 µl)在 SDS-PAGE 凝胶上。

2008 年 12 月发布

2021 年 4 月修订

Protocol Id: 410

免疫荧光（免疫细胞化学）A.溶液和试剂

注意：用反渗透去离子水 (RODI) 或等效纯化水制备溶液。

20X 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)：(9808) 要制备 1L 1X PBS：将 50 ml 20X PBS 添加到 950 ml dH2O，混匀。将 pH 值调节至 8.0。甲醛：16%，不含甲醇，Polysciences, Inc.（目录号 18814），使用新鲜的并打开的小瓶在 4°C 避光条件下储存，在 1X PBS 中稀释以备使用。甲醇，100% 封闭缓冲液（ 1X PBS / 5% 正常血清 / 0.3% Triton™ X-100）：要制备 10 ml，添加 0.5 ml 来自与二抗相同物种的正常血清（例如，Normal Goat Serum (#5425)）和 0.5 mL 20X PBS 至 9.0 mL dH2O，混匀。搅拌的同时，加入 30 µl Triton™ X-100。抗体稀释缓冲液（1X PBS / 1% BSA / 0.3% Triton X-100）：要制备 10 ml，将 30 µl Triton™ X-100 添加到 10 ml 1X PBS 中。混匀后加入 0.1 g BSA (9998)，混匀。

推荐荧光染料标记的抗兔二抗：

抗兔IgG (H+L), F(ab\')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) #4412Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab\')2 Fragment (Alexa Fluor® 555 Conjugate) #4413Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab\')2 Fragment (Alexa Fluor® 594 Conjugate) #8889Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab\')2 Fragment (Alexa Fluor® 647 Conjugate) #4414Prolong® Gold AntiFade Reagent (#9071), Prolong® Gold AntiFade Reagent with DAPI (#8961).B.标本制备 - 培养细胞系 (IF-IC)

注意：细胞应直接在多孔板、腔室载玻片或盖玻片上生长、处理、固定和染色。

吸出液体，然后将细胞覆盖到一定深度2-3 毫米，含 4% 甲醛，溶于 1X PBS。注意：甲醛有毒，只能在通风橱中使用。让细胞在室温下固定 15 分钟。吸出固定剂，在 1X PBS 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。继续进行免疫染色（C 部分）。免疫染色

注意：所有后续孵育均应在室温下进行，除非在潮湿的避光盒或 cov 中另有说明已标记培养皿/板以防止干燥和荧光染料褪色。

甲醇透化步骤：用冰冷的 100% 甲醇覆盖细胞（使用足以完全覆盖 3-5 毫米的深度，不要让其干燥），孵育在 –20°C 的甲醇中 10 分钟，在 1X PBS 中冲洗 5 分钟。在封闭缓冲液中封闭样本 60 分钟。封闭时，按照产品网页上的说明在抗体稀释缓冲液中稀释以制备一抗。吸出封闭液，应用稀释的一抗。在 4°C 下孵育过夜。在 1X PBS 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。在抗体稀释缓冲液稀释的荧光染料偶联二抗中孵育标本，室温避光孵育 1–2 小时。在 1X 中冲洗PBS 与步骤 6 相同。使用 Prolong® Gold Antifade Reagent (#9071)、Prolong® Gold AntiFade Reagent with DAPI (#8961) 盖玻片。为获得最佳结果，请立即使用适当的激发波长检查样品。如需长期储存，请将载玻片平放在 4°C 保护下从光编辑。

2006 年 11 月发布

2010 年 12 月修订

方案 ID：32

流式细胞术，兔抗体的甲醇透化方案 A .溶液和试剂

本方案所需的所有试剂都可以在我们的细胞内流式细胞术试剂盒（甲醇）#13593 中有效地一起购买，或者使用下面列出的目录号单独购买。

注意：使用反渗透制备溶液去离子 (RODI) 或同等级别的水。

1X 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)：要制备 1 L 1X PBS：将 100 ml 10X PBS (#12528) 添加到 900 ml 水混合物中。4% 甲醛，无甲醇(#47746)100% 甲醇 (#13604)：使用前冷藏抗体稀释缓冲液：购买即用型流式细胞术抗体稀释缓冲液 (#13616)，或通过溶解 0.5 g 牛血清白蛋白 (BSA) 制备 0.5% BSA PBS 缓冲液) (#9998) 溶于 100 ml 1X PBS。储存在 4°C。推荐的抗兔二抗::抗兔 IgG (H+L), F(ab\')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) #4412Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab\')2 Fragment (Alexa Fluor® 594 Conjugate) #8889Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab\')2 Fragment (Alexa Fluor® 647 Conjugate) #4414Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab\')2 Fragment (PE Con​​jugate) #79408

注意：当您的实验中包含荧光细胞染料（包括活性染料、DNA 染料、等），请参阅染料产品页面以了解推荐的方案。请访问 www.cellsignal.com 以获取经过验证可用于流式细胞术的细胞染料的完整列表。

B.固定

注意：贴壁细胞或组织应在固定前解离并置于单细胞悬液中。

注意：最佳离心条件将因细胞类型和试剂体积而异。一般来说，150-300g 1-5 分钟就足以沉淀细胞。

注意：如果使用全血，裂解红细胞并在固定前离心洗涤。

注意：靶向 CD 标记或其他细胞外蛋白的抗体可能如果表位被甲醛和/或甲醇破坏，则在固定前添加。在固定和透化过程中，抗体将保持与目标靶标的结合。但是，请注意，某些荧光团（包括 PE 和 APC）会被甲醇损坏，因此不应在透化之前添加。如果您不确定，请进行小规模实验。

离心沉淀细胞并去除上清液。每 100 万个细胞用大约 100 µl 4% 甲醛重悬细胞。充分混合以分离沉淀并防止单个细胞交联。在室温 (20-25°C) 下固定 15 分钟。用过量的 1X PBS 离心洗涤。在适当的废物容器中丢弃上清液。在 0.5-1 ml 1X PBS 中重悬细胞。继续进行透化步骤。或者，细胞可以在 4°C 的 1X PBS.C 中储存过夜。透化通过将冰冷的 100% 甲醇缓慢加入预冷的细胞中来透化细胞，同时轻轻地 vo涡旋，最终浓度为 90% 的甲醇。在冰上透化至少 10 分钟。继续进行免疫染色（D 部分）或将细胞储存在 -20°C 的 90% 甲醇中。D.免疫染色

注意：使用血细胞计数器或替代方法对细胞进行计数。

将所需数量的细胞等分到试管或孔中。 （通常，每次测定 5x105 至 1x106 个细胞。）通过在过量的 1X PBS 中离心来洗涤细胞以去除甲醇。将上清液丢弃在适当的废液容器中。必要时重复。在 100 µl 稀释的一抗中重悬细胞，该抗体在抗体稀释缓冲液中按推荐稀释度制备或通过滴定确定。在室温下孵育 1 小时。在抗体稀释缓冲液或 1X PBS 中离心洗涤。丢弃上清液。重复。在 100 µl 稀释的荧光染料偶联二抗中重悬细胞（按推荐稀释度在抗体稀释缓冲液中制备）。在室温下孵育 30 分钟。避光。洗 by 在抗体稀释缓冲液或 1X PBS 中离心。丢弃上清液。重复。在 200-500 µl 1X PBS 中重悬细胞并在流式细胞仪上进行分析。

2009 年 7 月发布

2020 年 6 月修订

Protocol Id : 404

染色质 IP

特定产品：SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005。

所需试剂

包含的试剂：

甘氨酸溶液 (10X) #7005Buffer A (4X) #7006Buffer B (4X) #7007ChIP Buffer (10X) #7008ChIP Elution Buffer (2X) #70095 M NaCl #70100.5 M EDTA #7011ChIP-Grade Protein G Magnetic Beads #9006DNA Binding Buffer #10007DNA Wash Buffer (使用前添加 4 倍体积乙醇）#10008DNA 洗脱缓冲液 #10009DNA 纯化柱和收集管 #10010Protease Inhibitor Cocktail (200X) #7012RNAse A (10 mg/ml) #7013Micrococcal Nuclease #10011Proteinase K (20 mg/ml) #10012SimpleChIP® Human RPL30 Exon 3 Primers 1 #7014SimpleChIP® Mouse RPL30 Intron 2 Primers 1 #7015Histone H3 (D2B12) XP&r例如;兔单克隆抗体（ChIP 配方）#4620Normal Rabbit IgG #2729DTT（二硫苏糖醇）#7016

试剂不包括在内：

磁力分离架#7017 / 14654磷酸盐缓冲盐水 (PBS-1X) pH7.2（无菌）#9872核酸酶-free Water #12931Ethanol (96-100%)Formaldehyde (37% Stock)SimpleChIP® Universal qPCR Master Mix #88989！这！表示协议中关于基于免疫沉淀准备 (IP 准备) 数量的体积变化的重要步骤。一份 IP 制备定义为 4 x 106 个组织培养细胞或 25 mg 或分解组织。！！这 !!表示在继续之前稀释缓冲区的重要步骤。安全停止如果需要停止，这是协议中的安全停止点。组织交联和样品制备

采集组织时，从样品中去除不需要的物质，例如脂肪和坏死物质。然后可以立即对组织进行处理和交联，或在干冰上冷冻并储存在 -80°C 下进行处理 l吃。为获得最佳染色质产量和 ChIP 结果，每次免疫沉淀使用 25 mg 组织。染色质产量确实因组织类型而异，有些组织每次免疫沉淀可能需要超过 25 mg。有关不同类型组织的预期染色质产量的更多信息，请参阅附录 A。应处理一份额外的染色质样品以进行染色质消化和浓度分析（第 IV 部分）。如果需要，应处理另外五个染色质样品以优化染色质消化（附录 B）。

开始前：

(!) 所有缓冲液体积应根据实验中 IP 制备的数量按比例增加.

取出并加热 200X 蛋白酶抑制剂混合物 (PIC) 和 10X 甘氨酸溶液。确保 PIC 完全解冻。准备 3 ml 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) + 15 µl 200X PIC 每 25 mg 要处理的组织并置于冰上。准备 45 µl 37% 的 fo每 25 毫克待处理组织的甲醛，并在室温下保存。使用未超过制造商有效期的新鲜甲醛。交联称重新鲜或冷冻的组织样本。对每个要执行的 IP 使用 25 mg 的组织（一个实验至少需要 75 mg 的组织，以包括阳性和阴性对照）。将组织样本放入 60 mm 或 100 mm 的培养皿中，并使用干净的细碎手术刀或刀片。把菜放在冰上。保持组织低温以避免蛋白质降解很重要。将切碎的组织转移到 15 ml 锥形管中。向锥形管中每 25 mg 组织添加 1 ml PBS + PIC。要将蛋白质交联到 DNA，添加 45 µl 37每 1 ml PBS + PIC 的甲醛百分比，并在室温下摇晃 20 分钟。最终甲醛浓度为 1.5%。通过每 1 ml PBS + PIC 添加 100 µl 10X 甘氨酸停止交联，并在室温下混合 5 分钟。在台式离心机中以 500 x g 离心组织 54°C 分钟。去除上清液并用 1 ml PBS + PIC 每 25 mg 组织洗涤一次。在台式离心机中 4°C 以 500 x g 重复离心 5 分钟。去除上清液并在 1 ml PBS + 中重悬组织每 25 毫克组织的 PIC 并储存在冰上。使用 Medimachine（B 部分）或 Dounce 匀浆器（C 部分）将组织分解成单细胞悬浮液。 （安全停止）或者，样品可以在分解前在 -80°C 下储存长达 3 个月。B.使用 BD Biosciences 的 Medimachine 进行组织分解（部件号 340587）切掉 1000 µL 移液器尖端的末端以扩大用于转移组织块的开口。将重悬于 PBS + PIC 中的 1 ml 组织转移到 50 mm 的顶部腔室中medicone（部件号 340592）。根据制造商的说明研磨组织 2 分钟。使用 1 ml 注射器和 18 号钝针从 medicone 的底部室收集细胞悬浮液。将细胞悬液转移到 15 ml 锥形管中并置于冰上。Rep执行步骤 2 至 4，直到所有组织都处理成均匀的悬浮液。如果需要更多研磨，请向组织中添加更多 PBS + PIC。重复步骤 2 至 5，直到所有组织都被研磨成均匀的悬浮液。通过显微镜（可选）检查单细胞悬浮液。在台式离心机中以 2,000 x g 的速度在 4°C 下将细胞离心 5 分钟。从细胞中去除上清液，然后继续细胞核制备和染色质消化（第 III 部分）.C。使用 Dounce 匀浆器进行组织分解将重新悬浮在 PBS + PIC 中的组织转移到 Dounce 匀浆器中。用 20-25 次冲程分解组织块。通过显微镜检查单细胞悬浮液（可选）。将细胞悬浮液转移到 15 ml 锥形管中，并在台式离心机中 4°C 下以 2,000 x g 离心 5 分钟。从细胞中去除上清液并继续进行细胞核制备和染色质消化（第三部分）。细胞培养物交联和样品制备

为获得最佳 ChIP 结果，请使用大约每次免疫沉淀需要 4 X 106 个细胞（至少需要 12 X 106 个细胞才能包括阳性和阴性对照）。对于 HeLa 细胞，一个 IP 相当于 15 cm 培养皿的一半，其中含有在 20 ml 生长培养基中达到 90% 汇合度的细胞。应处理一个额外的样本用于染色质消化和浓度分析（第 IV 部分）。由于每种细胞类型都不同，我们建议在实验中加入一皿额外的细胞，用于使用血细胞计数器或细胞计数器测定细胞数量。

开始之前

(!) 所有缓冲液体积都应增加根据使用的 15 cm 组织培养皿（或 20 ml 悬浮细胞）的数量按比例分配。

取出并加热 200X Protease Inhibitor Cocktail (PIC) #7012 和 10X Glycine Solution #7005。确保 PIC 完全解冻。每 15 cm 培养皿（或 20 ml 悬浮细胞）准备 2 ml 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) + 10 µl 200X PIC处理并置于冰上。每 15 厘米培养皿（或 20 毫升悬浮细胞）准备 40 毫升 PBS 进行处理并置于冰上。每 15 厘米培养皿（或 20 毫升悬浮细胞）准备 540 微升 37% 甲醛处理并在室温下保存。使用未超过制造商有效期的新鲜甲醛。要将蛋白质与 DNA 交联，请将 540 µl 37% 甲醛添加到每个包含 20 ml 培养基的 15 cm 培养皿中。对于悬浮细胞，向悬浮在 20 ml 培养基中的细胞中加入 540 µl 37% 甲醛（为实现悬浮细胞的最佳固定，固定时细胞密度应低于 0.5 x 106 个细胞/ml）。短暂旋转以混合并在室温下孵育 10 分钟。最终甲醛浓度为 1%。添加甲醛可能会导致培养基颜色发生变化。将 2 ml 10X 甘氨酸添加到每个含有 20 ml 培养基的 15 cm 培养皿中，短暂旋转以混合，并在室温下孵育 5 分钟。添加甘氨酸可能会导致颜色变化 of 培养基。对于悬浮细胞，将细胞转移到 50 ml 锥形管中，在台式离心机中 4°C 下以 500 x g 离心 5 分钟，然后用 20 ml 冰冷的 PBS 洗涤沉淀物两次。去除上清液并立即继续细胞核制备和染色质消化（第 III 部分）。对于贴壁细胞，去除培养基并用 20 ml 冰冷的 1X PBS 洗涤细胞两次，每次完全去除培养皿中的洗涤液。加入 2 ml 冰-冷 PBS + PIC 到每个 15 厘米的培养皿中。将细胞刮入冷缓冲液中。将所有培养皿中的细胞合并到一个 15 ml 锥形管中。在 4°C 的台式离心机中以 2,000 x g 离心细胞 5 分钟。去除上清液并立即继续细胞核制备和染色质消化（第 III 部分）。 （安全停止）或者，样品可以在 -80°C 下储存长达 3 个月。III。细胞核制备和染色质消化开始之前

(!) 所有缓冲液体积都应根据 IP 制备的数量按比例增加 i在实验中。

取出并加热 200X 蛋白酶抑制剂混合物 (PIC) #7012。确保在使用前完全解冻。准备 1 M DTT（192.8 mg DTT #7016 + 1.12 ml dH2O）。确保 DTT 晶体完全溶解。

(!!)重要提示：一旦溶解，将 1M DTT 储存在 -20°C 下。

取出并加热 10X ChIP Buffer #7008，确​​保 SDS 完全溶解.准备 1 ml 1X 缓冲液 A（250 µl 4X 缓冲液 A #7006 + 750 µl 水）+ 0.5 µl 1M DTT + 5 µl 200X PIC 每次 IP 制备并置于冰上。准备 1.1 ml 1X 缓冲液 B（275 µl 4X 缓冲液 B #7007 + 825 µl 水）+ 0.55 µl 1M DTT 每次 IP 准备并置于冰上。准备 100 µl 1X ChIP 缓冲液（10 µl 10X ChIP 缓冲液 #7008 + 90 µl 水）+ 0.5 µl 200X PIC 每次 IP 准备并置于ice. 在 1 ml 冰冷的 1X 缓冲液 A + DTT + PIC 中重悬细胞，每次 IP 制备。在冰上孵育 10 分钟。每 3 分钟通过倒置管混合。在台式 c 中以 2,000 x g 离心沉淀细胞核4°C 离心 5 分钟。每次 IP 制备时，去除上清液并在 1 ml 冰冷的 1X 缓冲液 B + DTT 中重悬沉淀。重复离心，去除上清液，并在每次 IP 制备时在 100 µl 1X 缓冲液 B + DTT 中重悬沉淀。将样品转移到 1.5 ml 微量离心管中，每管总量不超过 1 ml。每次 IP 制备添加 0.5 µl Micrococcal Nuclease #10011，倒置管数次混合，并在 37°C 下孵育 20 分钟，并频繁混合以消化 DNA到大约 150-900 bp 的长度。每 3 至 5 分钟颠倒混合一次。将 DNA 消化至最佳长度所需的微球菌核酸酶的量可能需要根据个体组织和细胞系的经验确定（参见附录 B）。每 4 x 106 个细胞用 0.5 µl 微球菌核酸酶消化的 HeLa 细胞核和每 25 mg 组织用 0.5 µl 微球菌核酸酶消化的小鼠肝组织得到适当长度的 DNA 片段。通过每次免疫沉淀制备添加 10 µl 0.5 M EDTA #7011 来停止消化A然后将试管置于冰上 1-2 分钟。通过在 4°C 下以 16,000 x g 的离心力在微量离心机中离心 1 分钟来沉淀细胞核并去除上清液。在 100 µl 1X ChIP 缓冲液 + PIC 中重悬核沉淀，每个 IP 制备并孵育冰浴 10 分钟。每 1.5 ml 微量离心管最多处理 500 µl 裂解物，并多次脉冲以破坏核膜。在脉冲之间将样品在湿冰上孵育 30 秒。细胞核完全裂解所需的最佳条件可以通过在超声处理前后在光学显微镜下观察细胞核来确定。使用 VirTis Virsonic 100 超声波匀浆器/声波仪，在设置 6 和 1/8 英寸探头的 3 组 20 秒脉冲后，HeLa 细胞核被完全裂解。或者，可以通过在 Dounce 匀浆器中将裂解物匀浆 20 次来裂解细胞核；然而，裂解可能不完全。通过在 4°C 下在微量离心机中以 9,400 x g 离心 10 分钟来澄清裂解物。将上清液转移到新管中。 （安全的STOP) 这是交联的染色质制剂，应在 -80°C 下保存直至进一步使用。取出 50 µl 染色质制备物用于染色质消化和浓度分析（第 IV 部分）。该 50 µl 样品可在 -20°C 下储存过夜。染色质消化和浓缩分析（推荐步骤）向 50 µl 染色质样品（来自第 III 部分中的步骤 9）添加 100 µl 无核酸酶水、6 µl 5 M NaCl #7010 和 2 µl RNAse A #7013。涡旋混合并在 37°C 下孵育样品 30 分钟。向每个 RNAse A 消化的样品中添加 2 µl 蛋白酶 K。涡旋混合并在 65°C 下孵育样品 2 小时。使用 DNA 纯化离心纯化样品中的 DNA列如第 VII 节所述。 （安全停止）DNA 可在 -20°C 下保存长达 6 个月。纯化 DNA 后，取出 10 µl 样品，并在带有 100 bp DNA 标记的 1% 琼脂糖凝胶上通过电泳确定 DNA 片段大小。脱氧核糖核酸应被消化至大约 150-900 bp 的长度（1 至 5 个核小体）。要确定 DNA 浓度，将 2 µl 纯化的 DNA 转移到 98 µl 无核酸酶的水中进行 50 倍稀释并读取 OD260。以 µg/ml 为单位的 DNA 浓度为 OD260 x 2,500。理想情况下，DNA 浓度应介于 50 和 200 µg/ml 之间。

注意：为获得最佳的 ChIP 结果，染色质的大小和浓度是否合适至关重要。染色质的过度消化可能会减少 PCR 定量中的信号。染色质消化不足可能导致背景信号增加和分辨率降低。在 IP 中添加的染色质太少可能会导致 PCR 定量中的信号减弱。染色质消化优化方案见附录 B.

V。染色质免疫沉淀

为获得最佳 ChIP 结果，每个免疫沉淀使用大约 5 至 10 µg 消化的交联染色质（如第 IV 部分中所确定）化。这应该大致相当于从 25 mg 分解组织或 4 x 106 个组织培养细胞中制备的 100 µl IP 制备物。通常，在添加抗体之前，将 100 µl 消化的染色质稀释到 400 µl 1X ChIP 缓冲液中。但是，如果每次 IP 需要超过 100 µl 的染色质，则交联染色质制备物无需按如下所述进行稀释。抗体可直接添加到未稀释的染色质制剂中，用于染色质复合物的免疫沉淀。

开始之前

(!) 所有缓冲液体积应根据实验中的免疫沉淀数量按比例增加。

去除和温暖的 200X 蛋白酶抑制剂混合物 (PIC) #7012。确保 PIC 完全解冻。取出并加热 10X ChIP Buffer #7008 并确保 SDS 完全溶解。解冻消化的染色质制备物（来自第 III 部分的第 9 步）并置于冰上。准备低盐洗涤液：3 ml 1X ChIP Buffer (300 µl 10X ChIP Buffer #7008 + 2.7 ml 水）每次免疫沉淀。在室温下储存直至使用。准备高盐洗涤液：每次免疫沉淀 1 ml 1X ChIP 缓冲液（100 µl 10X ChIP 缓冲液 #7008 + 900 µl 水）+ 70 µl 5M NaCl #7010。在室温下储存直至使用。在一个试管中，准备足够的 1X ChIP 缓冲液，用于将消化的染色质稀释成所需数量的免疫沉淀：400 µl 1X ChIP 缓冲液（40 µl 10X ChIP 缓冲液 + 360 µl 水）+ 2 µl每次免疫沉淀 200X PIC。确定免疫沉淀次数时，请记住包括阳性对照 Histone H3 (D2B12) XP® Rabbit mAb #4620 和阴性对照 Normal Rabbit IgG antibody #2729 样品。将混合物置于冰上。每次免疫沉淀时，向制备好的 1X ChIP 缓冲液中添加相当于 100 µl（5 至 10 µg 染色质）的消化交联染色质制剂（来自第 III 部分的第 9 步）。例如，对于 10 i免疫沉淀，准备一个含有 4 ml 1X ChIP 缓冲液（400 µl 10X ChIP 缓冲液 + 3.6 ml 水）+ 20 µl 200X PIC + 1 ml 消化染色质制剂的试管。取出 10 µl 稀释染色质样品并转移到微量离心管中。这是您的 2% Input Sample，可在 -20°C 下保存直至进一步使用（第 VI 部分中的步骤 1）。对于每次免疫沉淀，将 500 µl 稀释的染色质转移到 1.5 ml 微量离心管中并添加免疫沉淀抗体.每个 IP 所需的抗体量各不相同，应由用户确定。对于阳性对照 Histone H3 (D2B12) XP® Rabbit mAb #4620，向 IP 样品中添加 10 µl。对于阴性对照 Normal Rabbit IgG #2729，将 1 µl（1 µg）到 2 µl（2 µg）添加到 IP 样品中。如果使用 Cell Signaling Technology 的抗体，请参阅数据表或产品网页上列出的推荐稀释度，并计算 IgG 和基于 Cell Signaling 抗体浓度的抗体作为阴性对照，以进行公平比较。将 IP 样品在 4°C 下旋转孵育 4 小时至过夜。

注意：Cell Signaling Technology 的大多数抗体在每个 IP 样品 1 到 2 微克之间发挥最佳作用。如果有多个浓度不同的样品，最好将阴性对照 Normal Rabbit IgG #2729 与最高抗体浓度相匹配。

通过轻轻涡旋重悬 ChIP-Grade Protein G Magnetic Beads #9006。立即向每个 IP 反应中添加 30 µl 蛋白 G 磁珠，并在 4°C 下旋转孵育 2 小时。通过将试管置于磁力分离架 #7017 中，在每次免疫沉淀中沉淀蛋白 G 磁珠。等待 1 至 2 分钟使溶液变澄清，然后小心去除上清液。通过向磁珠中加入 1 ml 低盐洗涤液来清洗 G 蛋白磁珠，并在 4°C 下旋转孵育 5 分钟。重复步骤 6 和 7 另外两个 t共进行 3 次低盐洗涤。将 1 ml 高盐洗涤液添加到磁珠中，并在 4°C 下旋转孵育 5 分钟。通过将试管置于磁力分离架中，在每次免疫沉淀中沉淀蛋白 G 磁珠。等待 1 至 2 分钟使溶液变澄清，然后小心去除上清液。立即进入第 VI.VI 节。从抗体/蛋白 G 磁珠洗脱染色质和逆转交联开始之前

(!) 所有缓冲液体积应根据实验中的免疫沉淀数量按比例增加。

取出并加热 2X ChIP 洗脱在 37°C 水浴中缓冲 #7009，并确保 SDS 在溶液中。将水浴或热混合器设置为 65°C。准备 150 µl 1X ChIP 洗脱缓冲液（75 µl 2X ChIP 洗脱缓冲液 #7009 + 75 µl 水）用于每次免疫沉淀和 2% 输入样品。将 150 µl 1X ChIP 洗脱缓冲液添加到 2% 输入样品管中并在室温下放置直至第 6 步。向每个 IP 样品中添加 150 µl 1X ChIP 洗脱缓冲液。在 65°C 下轻轻涡旋（1,200 rpm）从抗体/蛋白 G 磁珠中洗脱染色质 30 分钟。恒温器最适合此步骤。或者，洗脱可以在室温下旋转进行，但可能不那么完整。通过将管放在磁力分离架上沉淀蛋白 G 磁珠，等待 1 至 2 分钟使溶液澄清。小心地将洗脱的染色质上清液转移到向所有试管（包括来自步骤 1 的 2% 输入样品）添加 6 µl 5M NaCl 和 2 µl Proteinase K #10012 进行反向交联，并在 65°C 下孵育 2 小时。该孵育可以延长过夜。立即进行第七部分。 （安全停止）或者，样品可以在 -20°C 下储存最多 4 天。但是，为避免形成沉淀，请确保在添加 DNA Binding Buffer #10007 之前将样品加热至室温（第 VII 部分，步骤 1）。VII。使用离心柱纯化 DNA 开始前 (!!) 使用前将 24 ml 乙醇 (96-100%) 添加到 DNA Wash Buffer #10008 中。此步骤只需在第一组 DNA 纯化之前执行一次。从第 V 部分中取出每个 DNA 样本的 DNA 纯化收集管 #10010。向每个 DNA 样本中添加 750 µl DNA Binding Buffer #10007 并短暂涡旋。5每 1 体积样品应使用 30 倍体积的 DNA 结合缓冲液。将步骤 1 中的每个样品 450 µl 转移至收集管中的 DNA 离心柱。在微量离心机中以 18,500 x g 离心 30 秒。从离心管中取出离心柱收集管并丢弃液体。更换收集管中的离心柱。将步骤 1 中每个样品剩余的 450 µl 转移到收集管中的离心柱中。重复步骤 3 和 4。将 750 µl DNA Wash Buffer #10008 添加到收集管中的离心柱中。在微量离心机中以 18,500 x g 离心 30 秒。从离心管中取出离心柱收集管并丢弃液体。更换收集管中的离心柱。在微量离心机中以 18,500 x g 离心 30 秒。丢弃收集管和液体。保留离心柱。将 50 µl DNA 洗脱缓冲液 #10009 添加到每个离心柱中，然后放入干净的 1.5 ml 微量离心管中。在微量离心机中以 18,000 x g 离心 30 秒以洗脱 DNA。移除并丢弃 DNA 离心柱。洗脱液现在是纯化的 DNA。 （安全停止）样品可以储存在 -20°C。VIII。通过 PCR 对 DNA 进行定量建议使用带过滤头的移液器吸头以最大限度地降低污染风险。试剂盒中包含的对照引物专用于人或小鼠 RPL30 基因 (#7014 + #7015)，可用于标准 PCR 或定量实时定量时间 PCR。如果用户对其他物种进行 ChIP，建议用户设计合适的 DNA 特异性引物并确定最佳 PCR 条件。建议使用热启动 Taq 聚合酶将非特异性 PCR 产物的风险降至最低。PCR 引物的选择至关重要。引物设计应严格遵守以下标准：引物长度：24 个核苷酸最佳 Tm：60°CO 最佳 GC：50% 扩增子大小：150 至 200 bp（用于标准 PCR）80 至 160 bp（用于实时定量 PCR）标准 PCR 方法根据要分析的样品数量标记适当数量的 0.2 ml PCR 管。这些应包括 2% 输入样本、阳性对照组蛋白 H3 样本、阴性对照正常兔 IgG 样本，以及一个没有 DNA 的试管以控制 DNA 污染。向每个试管中加入 2 µl 适当的 DNA 样本。准备一个主反应混合物如下所述，确保为两个额外的管添加足够的试剂以弥补体积损失。向每个反应管中加入 18 µl 预混液。 1 个 PCR 反应的试剂体积 (18 µl) 无核酸酶 H2O 12.5 µl10X PCR 缓冲液 2.0 µl4 mM dNTP Mix 1.0 µl5 µM RPL30 Primers 2.0 µlTaq DNA聚合酶 0.5 µl 启动以下PCR反应程序：a．初始变性 95°C 5 分钟。变性 95°C 30 秒。退火 62°C 30 秒。延伸 72°C 30 秒。重复步骤 b-d 总共 34 个周期。最终延伸 72°C 5 分钟 从每个 PCR 产物中取出 10 微升，用带有 100 bp DNA 标记的 2% 琼脂糖凝胶或 10% 聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。人 RPL30 #7014 的 PCR 产物的预期大小为 161 bp，小鼠 RPL30 #7015 的预期大小为 159 bp。实时定量 PCR 方法标记与要使用的 PCR 机器型号兼容的适当数量的 PCR 管或 PCR 板。 PCR 反应应包括阳性对照组蛋白 H3 样本、阴性对照正常兔 IgG 样本、不含用于控制污染的 DNA 的试管，以及连续稀释的 2% 输入染色质 DNA（未稀释、1:5、1:25 , 1:125) 创建标准曲线并确定扩增效率。添加 2 µl 适当的 DNA 样品到 PCR 板的每个管或孔中。如下所述制备主反应混合物。为两个额外的反应添加足够的试剂以弥补体积损失。向每个 PCR 反应管或孔中加入 18 µl 反应混合物。 （安全停止）如有必要，用铝箔盖板避光，并在 4°C 下储存最多 4 小时或 -20°C 过夜，直到机器准备好使用。1 次 PCR 反应的试剂体积 (18 µl)无核酸酶 H2O 6 µl5 µM RPL30 引物 2 µlSimpleChIP® Universal qPCR Master Mix #88989 10 µl 启动以下 PCR 反应程序：a.初始变性 95°C 3 分钟。变性 95°C 15 秒。退火和延伸：60°C 60 秒。重复步骤 b 和 c，共进行 40 个循环。

使用实时 PCR 仪提供的软件分析定量 PCR 结果。或者，可以使用百分比输入法手动计算 IP 效率，公式如下所示低的。使用这种方法，从每次免疫沉淀获得的信号表示为总输入染色质的百分比。

输入百分比 = 2% x 2(C[T] 2% 输入样本 - C[T] IP 样本)

C[T] = CT = PCR反应的阈值循环

IX. NG 测序文库构建

使用该试剂盒制备的免疫富集 DNA 样本可直接与 ChIP-seq 兼容。对于下游 NG 测序 DNA 文库构建，请使用与您的下游测序平台兼容的 DNA 文库制备方案或试剂盒。对于 Illumina® 平台上的测序，我们推荐用于 Illumina® 的 DNA 文库制备试剂盒（ChIP-seq、CUT&RUN）#56795 和其相关的索引引物 Multiplex Oligos for Illumina®（单索引引物）（ChIP-seq，CUT&RUN）#29580 或 Multiplex Oligos for Illumina®（双索引引物）（ChIP-seq，CUT&RUN）#47538。

建议：

对于转录因子或辅因子 ChIP-seq，使用至少 5 ng ChIP-enriched DNA 和扩增的 a适配器连接的 DNA 和 10 个 PCR 循环。对于总组蛋白和组蛋白修饰或输入样本，从 50 ng ChIP 富集 DNA 开始，然后用 6 个 PCR 循环扩增适配器连接的 DNA。对于 ChIP- 的文库构建富集所有目标类型的 DNA，在不选择大小的情况下对接头连接的 DNA 进行清理。DNA 文库构建后，使用安捷伦高灵敏度 DNA 试剂盒（Agilent Technologies，Cat#）检查 DNA 文库是否存在接头二聚体（~140 bp） G2938-90322)，或使用 50-100 ng DNA 在 2% 琼脂糖 TAE 凝胶上进行琼脂糖凝胶电泳。如果 DNA 文库中存在接头二聚体，请重复清理 PCR 扩增材料。文库的质量也可以使用 qPCR 和针对已知阳性和阴性目标位点的引物组来确认。阳性引物对仍应提供与比较相同的高信号如在 ChIP 富集 DNA 的原始 qPCR 分析中所见，为负引物。在最终清理和质量检查后，准备最终纯化的文库样本浓度为 2-10 nM，用于高通量测序。附录 A：预期染色质产量

从组织样本中收获交联染色质时，染色质产量在不同组织类型之间可能存在显着差异。右表提供了与 4 x 106 HeLa 细胞相比，25 毫克组织的染色质预期产量范围，以及预期的 DNA 浓度，如方案第 IV 节中所确定。对于每种组织类型，使用Medimachine (BD Biosciences) 或 Dounce 匀浆器产生相似数量的染色质。但是，使用 Medimachine 解聚的组织处理的染色质通常比使用 Dounce 匀浆器解聚的组织处理的染色质具有更高的 IP 效率。强烈建议使用 Dounce 匀浆器来分解脑组织，因为 Medimachine 不能将脑组织充分分解成单细胞悬浮液。为了获得最佳的 ChIP 结果，我们建议使用每次免疫沉淀 ng 5 至 10 µg 消化的交联染色质；因此，有些组织每次免疫沉淀可能需要收获超过 25 mg。

组织/细胞总染色质产量预期 DNA 浓度脾脏 20-30 µg/25 mg 组织 200-300 µg/ml 肝脏 10-15 µg/25 mg 组织 100- 150 µg/ml 肾脏 每 25 mg 组织 8-10 µg 80-100 µg/mlBrain 每 25 mg 组织 2-5 µg 20-50 µg/ml 心脏 每 25 mg 组织 2-5 µg 20-50 µg/mlHeLa 10-15 µg每 4 x 106 个细胞 100-150 µg/ml 附录 B：染色质消化的优化

将交联染色质 DNA 消化至 150-900 个碱基对长度的最佳条件在很大程度上取决于微球菌核酸酶与消化中使用的组织量或细胞数量。以下是确定特定组织或细胞类型的最佳消化条件的方案。

从 125 mg 组织中制备交联细胞核或 2 X 107 个细胞（相当于 5 次 IP 制备），如第 I、II 和 III 部分所述。在第 III 部分的第 2 步后停止并按如下所述进行。将 100 µl 细胞核制备物转移到 5 个单独的 1.5 ml 微量离心机中试管并置于冰上。将 3 µl 微球菌核酸酶原液添加到 27 µl 1X 缓冲液 B + DTT（酶的 1:10 稀释度）中。向步骤 2 中的 5 个试管中的每一个添加 0 µl、2.5 µl、5 µl、 7.5 µl 或 10 µl 稀释的微球菌核酸酶，通过倒置试管多次混合，并在 37°C 下频繁混合孵育 20 分钟。通过添加 10 µl 0.5 M EDTA 停止每次消化并将试管置于冰上。沉淀核通过在 4°C 下在微量离心机中以 16,000 x g 离心 1 分钟并去除上清液。在 200 µl 1X ChIP 缓冲液 + PIC 中重悬核沉淀。在冰上孵育 10 分钟。用几个脉冲对裂解物进行超声处理以破坏核膜。在脉冲之间将样品在湿冰上孵育 30 秒。选择细胞核完全裂解所需的最终条件可通过在光学显微镜下观察超声处理前后的细胞核来确定。使用 VirTis Virsonic 100 超声波匀浆器/声波仪，在 3 组 20 秒脉冲后，HeLa 细胞核完全裂解，设置为设置 6，带有 1/8 英寸探头。或者，可以通过在 Dounce 匀浆器中将裂解物匀浆 20 次来裂解细胞核；然而，裂解可能不那么完整。通过在 4°C 下在微量离心机中以 9,400 x g 离心 10 分钟来澄清裂解物。将 50 µl 的每种超声裂解物转移到新的微量离心管中。向每 50 µl 样品中加入 100 µl无核酸酶水、6 µl 5 M NaCl 和 2 µl RNAse A。涡旋混合并在 37°C 下孵育样品 30 分钟。向每个 RNAse A 消化的样品中加入 2 µl 蛋白酶 K。涡旋混合并孵育样品在 65°C 下 2 小时。从每个样品中取出 20 µl，并通过在 1% 琼脂糖凝胶 w 上进行电泳来确定 DNA 片段大小带有 100 bp DNA 标记。观察哪种消化条件可产生 150-900 个碱基对（1 至 5 个核小体）所需范围内的 DNA。使用此优化方案产生所需大小的 DNA 片段的稀释微球菌核酸酶体积相当于应添加到一种免疫沉淀制备物（25 毫克分解组织细胞或 4 X 106 组织培养物）中的微球菌核酸酶原液体积的 10 倍细胞）以产生所需大小的 DNA 片段。例如，如果 5 µl 稀释的微球菌核酸酶在此实验方案中产生 150-900 个碱基对的 DNA 片段，则在第 III 部分的染色质消化过程中，应将 0.5 µl 微球菌核酸酶原液添加到一次免疫沉淀制备中。如果结果表明DNA 不在所需的大小范围内，然后重复优化方案，相应地调整每次消化中微球菌核酸酶的量。或者，可以更改消化时间以增加或减少了解 DNA 片段化的程度。附录 C：故障排除指南问题可能原因建议 1.消化染色质的浓度太低。添加到染色质消化中的细胞不足或细胞核在消化后未完全裂解。

如果染色质制剂的 DNA 浓度接近 50 µg/ml，则向每个 IP 添加额外的染色质以提供至少 5 µg/IP 并继续执行方案。

对单独的细胞板进行计数在交联之前确定准确的细胞数和/或在超声处理前后在显微镜下观察细胞核以确认细胞核完全裂解。

2.染色质消化不足且片段太大（大于 900 bp）。

细胞可能过度交联。交联时间超过 10 分钟可能会抑制染色质的消化。

染色质消化中添加的细胞过多或微球菌核酸酶不足。

以固定时间执行时间进程甲醛浓缩液离子。将交联时间缩短至 10 分钟或更短。

在交联前对单独的细胞板进行计数以确定准确的细胞数，并参见附录 B 以优化染色质消化。

3 .染色质过度消化且片段太小（仅 150 bp 单核小体长度）。将染色质完全消化成单核小体长度的 DNA 可能会在 PCR 定量期间减弱信号，尤其是对于长度大于 150 bp 的扩增子。没有足够的细胞或添加到染色质消化中的微球菌核酸酶过多。在交联前对单独的细胞板进行计数，以确定准确的细胞数，有关染色质消化的优化，请参见附录 B。 4．输入 PCR 反应中没有产物或产物很少。

没有足够的 DNA 添加到 PCR 反应或条件不是最佳的。

PCR 扩增区域可能跨越无核小体区域。

没有足够的染色质添加到 IP 或染色质被过度消化了。

添加更多将 DNA 添加到 PCR 反应或增加扩增循环数。

使用从交联和消化的染色质中纯化的 DNA 优化实验引物组的 PCR 条件。设计不同的引物组并将扩增子的长度减少到 150 bp 以下（参见第 VIII 节中的引物设计建议）。

为获得最佳的 ChIP 结果，每个 IP 添加 5-10 µg 染色质。参见上面问题 1 和 3 的建议。

5．阳性对照组蛋白 H3-IP RPL30 PCR 反应中没有产物。

IP 反应中加入的染色质或抗体不足或 IP 孵育时间太短。

Protein G beads 染色质洗脱不完全。

务必添加 5- 10 µg 染色质和 10 µl 抗体用于每个 IP 反应，并与抗体一起孵育过夜，并在添加蛋白 G 珠子后再孵育 2 小时。

从蛋白 G 珠子上洗脱染色质的最佳温度为 65° C 经常搅拌以保持珠子悬浮在溶液中。

6．阴性对照兔 IgG-IP 和阳性对照组蛋白 H3-IP PCR 反应中的产物量是相等的。

IP 反应中添加的染色质过多或不足。或者，IP 反应中添加了过多的抗体。

PCR 反应中添加了过多的 DNA 或扩增循环过多。

添加的染色质不超过 15 µg 和 10微升组蛋白 H3 抗体用于每个 IP 反应。将每次 IP 的正常兔 IgG 的量减少至 1 µl。

在 PCR 反应中添加较少的 DNA 或减少 PCR 循环数。在 PCR 的线性扩增阶段分析 PCR 产物非常重要。否则无法准确测定起始DNA量的差异。

7．实验抗体-IP PCR 反应中没有产物。

没有足够的 DNA 添加到 PCR 反应。

没有足够的抗体添加到 IP 反应。

抗体不适用于 IP。

添加更多 DNA 用于 PCR 反应或增加扩增循环数。

通常，IP 反应中会添加 1 至 5 µg 范围内的抗体；但是，确切的量在很大程度上取决于单个抗体。

增加添加到 IP 的抗体量。寻找替代抗体来源。

2011 年 12 月发布

2022 年 4 月修订

方案 ID：82

染色质 IP

特定于产品：SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit（Magnetic Beads）#9005。

所需试剂

包括的试剂：

Glycine Solution (10X) #7005Buffer A (4X) #7006Buffer B (4X) #7007ChIP Buffer (10X) #7008ChIP Elution Buffer (2X) #70095 M NaCl #70100.5 M EDTA #7011ChIP-Grade Protein G Magnetic Beads #9006DNA Binding Buffer #10007DNA Wash Buffer（使用前加入 4 倍体积的乙醇）# 10008DNA 洗脱缓冲液 #10009DNA 纯化柱 #10010Protease Inhibitor Cocktail (200X) #7012RNAse A (10 mg/ml) #7013Micrococcal Nuclease (2000 gel units/µl) #10011ProteinaseK (20 mg/ml) #10012SimpleChIP® Human RPL30 Exon 3 Primers 1 #7014SimpleChIP® Mouse RPL30 Intron 2 Primers 1 #7015Histone H3 (D2B12) XP® Rabbit mAb (ChIP Formulated) #4620Normal Rabbit IgG #2729DTT (Dithiothreitol) #7016

不包括试剂：

磁力分离架 #7017 / 14654磷酸盐缓冲盐水 (PBS-1X) pH7.2（无菌）#9872Nuclease-free Water #12931Ethanol (96-100%)Formaldehyde (37% Stock) Taq DNA 聚合酶 NTP MixI。组织交联和样品制备

采集组织时，从样品中去除不需要的物质，例如脂肪和坏死物质。然后可以立即对组织进行处理和交联，或在干冰上冷冻以备后用。为获得最佳染色质产量和 ChIP 结果，每次免疫沉淀使用 25 mg 组织。染色质产量确实因组织类型而异，有些组织每次免疫沉淀可能需要超过 25 mg。请参阅附录 A 了解更多信息研究不同类型组织的预期染色质产量。应处理一份额外的染色质样品以进行染色质消化和浓度分析（第 IV 部分）。

开始之前：取出并加热 200X 蛋白酶抑制剂混合物 (PIC) 和 10X 甘氨酸溶液。确保 PIC 完全解冻。每 25 mg 待处理组织准备 3 ml 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) + 15 µl 200X PIC 并置于冰上。每 25 mg 待处理组织准备 45 µl 37% 甲醛并保持在室温下。使用未超过制造商有效期的新鲜甲醛。交联称重新鲜或冷冻的组织样本。每个要执行的 IP 使用 25 毫克的组织。将组织样本放入 60 毫米或 100 毫米的盘子中，并使用干净的手术刀或剃须刀片切碎。把菜放在冰上。保持组织低温以避免蛋白质降解很重要。将切碎的组织转移到 15 ml 锥形管中。每 25 mg ti 添加 1 ml PBS + PIC加入锥形管。为了使蛋白质与 DNA 交联，每 1 ml PBS + PIC 添加 45 µl 37% 甲醛，并在室温下摇晃 20 分钟。最终甲醛浓度为 1.5%。通过每 1 ml PBS + PIC 添加 100 µl 10X 甘氨酸来停止交联，并在室温下混合 5 分钟。在台式离心机中以 1,500 rpm 的速度在 4°C 下将组织离心 5 分钟.去除上清液，每 25 mg 组织用 1 ml PBS + PIC 洗涤一次。在台式离心机中在 4°C 下以 1,500 rpm 重复离心 5 分钟。去除上清液，每 25 mg 组织用 1 ml PBS + PIC 重悬组织并储存在冰上。使用 Medimachine（B 部分）或 Dounce 匀浆器（C 部分）将组织分解成单细胞悬浮液。B.使用 BD Biosciences 的 Medimachine 进行组织分解（部件号 340587）切掉 1000 µL 移液器尖端的末端以扩大用于转移组织块的开口。将重悬于 PBS + PIC 中的 1 ml 组织转移到 50 mm 的顶部腔室中医学圆锥（部件号 340592）。根据制造商的说明研磨组织 2 分钟。使用 1 ml 注射器和 18 号钝针从 medicone 的底部室收集细胞悬浮液。将细胞悬浮液转移到 15 ml 锥形管中并置于冰上。重复步骤 2 至 4，直到所有组织都处理成均质悬浮液。如果需要更多研磨，请向组织中添加更多 PBS + PIC。重复步骤 2 至 5，直到所有组织都被研磨成均匀的悬浮液。通过显微镜（可选）检查单细胞悬浮液。在台式离心机中于 4°C 下以 1,500 rpm 的速度离心细胞 5 分钟。从细胞中去除上清液并立即继续细胞核制备和染色质消化（第 III 部分）。C。使用 Dounce 匀浆器进行组织分解将重新悬浮在 PBS + PIC 中的组织转移到 Dounce 匀浆器中。用 20-25 次冲程分解组织块。通过显微镜检查单细胞悬浮液（可选）。将细胞悬浮液转移到 15 ml 锥形管中离心管并在 4°C 的台式离心机中以 1,500 rpm 的速度离心 5 分钟。从细胞中去除上清液并立即继续细胞核制备和染色质消化（第 III 部分）。细胞培养物交联和样品制备

为获得最佳 ChIP 结果，每次免疫沉淀使用大约 4 X 106 个细胞。对于 HeLa 细胞，这相当于 15 cm 培养皿的一半，其中含有在 20 ml 生长培养基中 90% 汇合的细胞。应处理一个额外的样本用于染色质消化和浓度分析（第 IV 部分）。在实验中加入一盘额外的细胞，用于使用血细胞计数器测定细胞数量。

开始前取出并加热 200X 蛋白酶抑制剂混合物 (PIC) #7012 和 10X 甘氨酸溶液 #7005。确保 PIC 完全解冻。准备 2 ml 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) + 10 µl 200X PIC 每 15 cm 培养皿进行处理并置于冰上。准备 40 ml PBS每 15 厘米培养皿待处理并置于冰上。每 15 厘米待处理细胞培养皿准备 540 微升 37% 甲醛，并在室温下保存。使用未超过制造商有效期的新鲜甲醛。要将蛋白质与 DNA 交联，请将 540 µl 37% 甲醛添加到每个包含 20 ml 培养基的 15 cm 培养皿中。短暂旋转以混合并在室温下孵育 10 分钟。最终甲醛浓度为 1%。添加甲醛可能会导致培养基颜色发生变化。将 2 ml 10X 甘氨酸添加到每个含有 20 ml 培养基的 15 cm 培养皿中，短暂旋转以混合，并在室温下孵育 5 分钟。添加甘氨酸可能会导致培养基颜色发生变化。对于悬浮细胞，将细胞转移到 50 ml 锥形管中，在台式离心机中 4°C 下以 1,500 rpm 离心 5 分钟，然后用 20 ml 冰洗涤沉淀两次冷 PBS。去除上清液并立即继续细胞核制备和染色质消化（第三部分）.对于贴壁细胞，去除培养基并用 20 ml 冰冷的 1X PBS 洗涤细胞两次，每次完全去除培养皿中的洗涤液。将 2 ml 冰冷的 PBS + PIC 添加到每个 15 cm 的培养皿中。将细胞刮入冷缓冲液中。将所有培养皿中的细胞合并到一个 15 ml 锥形管中。在 4°C 的台式离心机中以 1,500 rpm 的转速离心细胞 5 分钟。去除上清液并立即继续细胞核制备和染色质消化（第 III 部分）。细胞核制备和染色质消化

一次免疫沉淀制备（IP 制备）定义为 25 mg 分解组织或 4 x 106 个组织培养细胞。

开始前取出并加热 200X Protease Inhibitor Cocktail (PIC) #7012。确保在使用前完全解冻。

准备 1 M DTT（192.8 mg DTT #7016 + 1.12 ml dH2O）。确保 DTT 晶体完全溶解。

重要提示：溶解后，将 1M DTT 储存在 -20°C 下。

取出并加热 10X ChIP Buffer #7008，确​​保 SDS 完整etely 在溶液中。准备 1 ml 1X 缓冲液 A（250 µl 4X 缓冲液 A #7006 + 750 µl 水）+ 0.5 µl 1M DTT + 5 µl 200X PIC 每次 IP 准备并置于冰上。准备 1.1 ml 1X 缓冲液 B（275 µl 4X 缓冲液 B #7007 + 825 µl 水）+ 0.55 µl 1M DTT 每次 IP 准备并置于冰上。准备 100 µl 1X ChIP 缓冲液（10 µl 10X ChIP 缓冲液 #7008 + 90 µl 水）+ 0.5 µl 200X PIC 每次 IP 准备并置于冰上。每次 IP 制备时，将细胞重悬于 1 ml 冰冷的 1X 缓冲液 A + DTT + PIC 中。在冰上孵育 10 分钟。每 3 分钟通过倒置管混合。在 4°C 的台式离心机中以 3,000 rpm 离心 5 分钟以沉淀细胞核。每次 IP 制备时，去除上清液并在 1 ml 冰冷的 1X 缓冲液 B + DTT 中重悬沉淀。重复离心，去除上清液，并在每次 IP 制备时在 100 µl 1X 缓冲液 B + DTT 中重悬沉淀。将样品转移到 1.5 ml 微量离心管中，每管总量不超过 1 ml。每次 IP 添加 0.5 µl Micrococcal Nuclease #10011准备、颠倒管数次混匀并在 37°C 下孵育 20 分钟，并频繁混匀以将 DNA 消化至约 150-900 bp 的长度。每 3 至 5 分钟颠倒混合一次。将 DNA 消化至最佳长度所需的微球菌核酸酶的量可能需要根据个体组织和细胞系的经验确定（参见附录 B）。每 4 x 106 个细胞用 0.5 µl 微球菌核酸酶消化的 HeLa 细胞核和每 25 mg 组织用 0.5 µl 微球菌核酸酶消化的小鼠肝组织得到适当长度的 DNA 片段。通过每次免疫沉淀制备添加 10 µl 0.5 M EDTA #7011 来停止消化并将试管置于冰上。在 4°C 下在微量离心机中以 13,000 rpm 离心 1 分钟以沉淀细胞核，然后去除上清液。根据 IP 制备在 100 µl 1X ChIP 缓冲液 + PIC 中重悬核沉淀，并在冰上孵育 10 分钟。每个 1.5 ml 微量离心管最多可处理 500 µl 裂解物，并使用多个脉冲来破坏核膜。我在脉冲之间将样品在湿冰上孵育 30 秒。细胞核完全裂解所需的最佳条件可以通过在超声处理前后在光学显微镜下观察细胞核来确定。使用 VirTis Virsonic 100 超声波匀浆器/声波仪，在设置 6 和 1/8 英寸探头的 3 组 20 秒脉冲后，HeLa 细胞核被完全裂解。或者，可以通过在 Dounce 匀浆器中将裂解物匀浆 20 次来裂解细胞核；然而，裂解可能不完全。通过在 4°C 下在微量离心机中以 10,000 rpm 离心 10 分钟来澄清裂解物。将上清液转移到新管中。这是交联染色质制剂，应在 -80°C 下保存直至进一步使用。取出 50 µl 染色质制备物，用于分析染色质消化和浓度（第 IV 部分）。染色质消化和浓缩分析（推荐步骤）向 50 µl 染色质样品（来自第 III 部分中的步骤 9）添加 100 µl nuclease-free 水、6 µl 5 M NaCl #7010 和 2 µl RNAse A #7013。涡旋混合并在 37°C 下孵育样品 30 分钟。向每个 RNAse A 消化的样品中添加 2 µl 蛋白酶 K。涡旋混合并在 65°C 下孵育样品 2 小时。使用 DNA 纯化离心纯化样品中的 DNA如第 VII 节所述的柱。纯化 DNA 后，取出 10 µl 样品，并通过在带有 100 bp DNA 标记的 1% 琼脂糖凝胶上进行电泳来确定 DNA 片段大小。 DNA 应被消化至大约 150-900 bp 的长度（1 至 5 个核小体）。要确定 DNA 浓度，请将 2 µl 纯化的 DNA 转移到 98 µl 无核酸酶的水中进行 50 倍稀释并读取 OD260。以 µg/ml 为单位的 DNA 浓度为 OD260 x 2,500。理想情况下，DNA 浓度应介于 50 和 200 µg/ml 之间。

注意：为获得最佳的 ChIP 结果，染色质的大小和浓度是否合适至关重要。染色质的过度消化可能会导致减少 PCR 定量中的信号。染色质消化不足可能导致背景信号增加和分辨率降低。在 IP 中添加的染色质太少可能会导致 PCR 定量中的信号减弱。染色质消化优化方案见附录 B.

V。染色质免疫沉淀

为获得最佳 ChIP 结果，每次免疫沉淀使用大约 5 至 10 µg 消化的交联染色质（如第 IV 部分中所确定）。这应该大致相当于从 25 mg 分解组织或 4 x 106 个组织培养细胞中制备的 100 µl IP 制备物。通常，在添加抗体之前，将 100 µl 消化的染色质稀释到 400 µl 1X ChIP 缓冲液中。但是，如果每次 IP 需要超过 100 µl 的染色质，则交联染色质制备物无需按如下所述进行稀释。抗体可以直接添加到未稀释的染色质制剂中进行免疫预染色质复合物的沉淀。

开始之前取出并加热 200X 蛋白酶抑制剂混合物 (PIC) #7012。确保 PIC 完全解冻。取出并加热 10X ChIP Buffer #7008 并确保 SDS 完全溶解。解冻消化的染色质制备物（来自第 III 部分的第 9 步）并置于冰上。准备低盐洗涤液：3 ml 1X ChIP Buffer （300 微升 10X ChIP 缓冲液 #7008 + 2.7 毫升水）每次免疫沉淀。在室温下储存直至使用。准备高盐洗涤液：每次免疫沉淀 1 ml 1X ChIP 缓冲液（100 µl 10X ChIP 缓冲液 #7008 + 900 µl 水）+ 70 µl 5M NaCl #7010。在室温下储存直至使用。在一个试管中，准备足够的 1X ChIP 缓冲液，用于将消化的染色质稀释成所需数量的免疫沉淀：400 µl 1X ChIP 缓冲液（40 µl 10X ChIP 缓冲液 + 360 µl 水）+ 2 µl每次免疫沉淀 200X PIC。在确定免疫沉淀次数时，请记住将 po阳性对照 Histone H3 (D2B12) XP® Rabbit mAb #4620 和阴性对照 Normal Rabbit IgG antibody #2729 样品。将混合物置于冰上。每次免疫沉淀时，向制备好的 1X ChIP 缓冲液中添加相当于 100 µl（5 至 10 µg 染色质）的消化交联染色质制剂（来自第 III 部分的第 9 步）。例如，对于 10 次免疫沉淀，准备一个含有 4 ml 1X ChIP 缓冲液（400 µl 10X ChIP 缓冲液 + 3.6 ml 水）+ 20 µl 200X PIC + 1 ml 消化染色质制剂的试管。取出 10 µl 稀释染色质样品并转移到微量离心管。这是您的 2% Input Sample，可在 -20°C 下保存直至进一步使用（第 VI 部分中的步骤 1）。对于每次免疫沉淀，将 500 µl 稀释的染色质转移到 1.5 ml 微量离心管中并添加免疫沉淀抗体.每个 IP 所需的抗体量各不相同，应由用户确定。对于阳性对照组蛋白 H3 (D2B12) XP® Rabbit mAb #4620，将 10 µl 添加到 IP 样品中。对于阴性对照 Normal Rabbit IgG #2729，将 1 µl（1 µg）到 2 µl（2 µg）添加到 IP 样品中。将 IP 样品在 4°C 下旋转孵育 4 小时至过夜。

注意：Cell Signaling Technology 的大多数抗体在每个 IP 样品 1 到 2 微克之间发挥最佳作用。如果有多个浓度不同的样品，最好将阴性对照 Normal Rabbit IgG #2729 与最高抗体浓度相匹配。

通过轻轻涡旋重悬 ChIP-Grade Protein G Magnetic Beads #9006。立即向每个 IP 反应中添加 30 µl 蛋白 G 磁珠，并在 4°C 下旋转孵育 2 小时。通过将试管置于磁力分离架 #7017 中，在每次免疫沉淀中沉淀蛋白 G 磁珠。等待 1 到 2 分钟使溶液变澄清，然后小心去除上清液。通过向 b 中加入 1 ml 低盐洗涤液来洗涤蛋白 G 磁珠eads 并在 4°C 下旋转孵育 5 分钟。再重复步骤 6 和 7 两次，共进行 3 次低盐洗涤。将 1 ml 高盐洗涤液加入磁珠中，并在 4°C 下旋转孵育 5 分钟。通过将磁选架中的试管。等待 1 至 2 分钟使溶液变澄清，然后小心去除上清液。立即进入第 VI.VI 节。从抗体/蛋白 G 磁珠洗脱染色质和逆转交联开始前取出 2X ChIP 洗脱缓冲液 #7009 并在 37°C 水浴中加热，确保 SDS 在溶液中。将水浴或热混合器设置为 65°C。为每次免疫沉淀和 2% 输入样品准备 150 µl 1X ChIP 洗脱缓冲液（75 µl 2X ChIP 洗脱缓冲液 #7009 + 75 µl 水）。将 150 µl 1X ChIP 洗脱缓冲液添加到 2% 输入样品管中并备用在室温下进行第 6 步。添加 150 µl 1X ChIP Elu每个 IP 样品的缓冲液。在 65°C 下轻轻涡旋（1,200 rpm）从抗体/蛋白 G 磁珠中洗脱染色质 30 分钟。恒温器最适合此步骤。或者，洗脱可以在室温下旋转进行，但可能不那么完整。通过将管放在磁力分离架上沉淀蛋白 G 磁珠，等待 1 至 2 分钟使溶液澄清。小心地将洗脱的染色质上清液转移到向所有试管（包括来自步骤 1 的 2% 输入样品）添加 6 µl 5M NaCl 和 2 µl Proteinase K #10012 进行反向交联，并在 65°C 下孵育 2 小时。该孵育可以延长过夜。立即进行第七部分。或者，样品可以储存在 -20°C。但是，为避免形成沉淀，请确保在添加 DNA Binding Buffer #10007 之前将样品加热至室温（第 VII 部分，步骤 1）。VII。使用离心柱纯化 DNA 开始前添加 24 ml 等使用前将乙醇 (96-100%) 添加到 DNA Wash Buffer #10008 中。此步骤只需在第一组 DNA 纯化之前执行一次。从第 V 部分中取出每个 DNA 样本的 DNA 纯化收集管 #10010。向每个 DNA 样本中添加 750 µl DNA Binding Buffer #10007 并短暂涡旋。5每 1 体积样品应使用 30 倍体积的 DNA 结合缓冲液。将步骤 1 中的每个样品 450 µl 转移至收集管中的 DNA 离心柱。在微量离心机中以 14,000 rpm 离心 30 秒。从离心管中取出离心柱收集管并丢弃液体。更换收集管中的离心柱。将步骤 1 中每个样品剩余的 450 µl 转移到收集管中的离心柱中。重复步骤 3 和 4。将 750 µl DNA Wash Buffer #10008 添加到收集管中的离心柱。在微量离心机中以 14,000 rpm 离心 30 秒。从收集管中取出离心柱并弃去液体。更换离心柱e 收集管。在微量离心机中以 14,000 rpm 离心 30 秒。丢弃收集管和液体。保留离心柱。将 50 µl DNA 洗脱缓冲液 #10009 添加到每个离心柱中，然后放入干净的 1.5 ml 微量离心管中。在微量离心机中以 14,000 rpm 离心 30 秒以洗脱 DNA。移除并丢弃 DNA 离心柱。洗脱液现在是纯化的 DNA。样品可以储存在-20°C。VIII。通过 PCR 对 DNA 进行定量建议使用带过滤头的移液器吸头以最大限度地降低污染风险。试剂盒中包含的对照引物专用于人或小鼠 RPL30 基因 (#7014 + #7015)，可用于标准 PCR 或定量实时定量时间 PCR。如果用户对其他物种进行 ChIP，建议用户针对 DNA 设计合适的特异性引物并确定最佳 PCR 条件。建议使用热启动 Taq 聚合酶以最大限度地降低非特异性 PCR 产物的风险。PCR 引物选择很关键。 P设计引物时应严格遵守以下标准：引物长度：24 个核苷酸最佳 Tm：60°CO 最佳 GC：50% 扩增子大小：150 至 200 bp（用于标准 PCR）80 至 160 bp（用于实时定量 PCR）标准 PCR 方法根据要分析的样品数量标记适当数量的 0.2 ml PCR 管。这些应包括 2% 输入样本、阳性对照组蛋白 H3 样本、阴性对照正常兔 IgG 样本，以及一个没有 DNA 的试管以控制 DNA 污染。向每个试管中加入 2 µl 适当的 DNA 样本。准备一个主反应混合物如下所述，确保为两个额外的管添加足够的试剂以弥补体积损失。向每个反应管中加入 18 µl 预混液。 1 个 PCR 反应的试剂体积 (18 µl) 无核酸酶 H2O 12.5 µl10X PCR 缓冲液 2.0 µl4 mM dNTP Mix 1.0 µl5 µM RPL30 引物 2.0 µlTaq DNA 聚合酶 0.5 µl 开始以下 PCR 反应程序：a.初始变性 95°C 5 分钟。变性 95°C 30 秒。退火 62°C 30 秒。延伸 72°C 30 秒。重复步骤 b-d 总共 34 个周期。最终延伸 72°C 5 分钟 从每个 PCR 产物中取出 10 微升，用带有 100 bp DNA 标记的 2% 琼脂糖凝胶或 10% 聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。人 RPL30 #7014 的 PCR 产物的预期大小为 161 bp，小鼠 RPL30 #7015 的预期大小为 159 bp。实时定量 PCR 方法标记与要使用的 PCR 机器型号兼容的适当数量的 PCR 管或 PCR 板。 PCR 反应应包括阳性对照组蛋白 H3 样本、阴性对照正常兔 IgG 样本、不含用于控制污染的 DNA 的试管，以及连续稀释的 2% 输入染色质 DNA（未稀释、1:5、1:25 , 1:125) 以创建标准曲线并确定扩增效率。将 2 µl 适当的 DNA 样本添加到 PCR 板的每个管或孔中。准备主反应混合物如下所述。为两个额外的反应添加足够的试剂以弥补体积损失。向每个 PCR 反应管或孔中加入 18 µl 反应混合物。1 个 PCR 反应的试剂体积 (18 µl) 无核酸酶 H2O 6 µl5 µM RPL30 引物 2 µlSYBR-Green 反应混合物 10 µl 启动以下 PCR 反应程序：a.初始变性 95°C 3 分钟。变性 95°C 15 秒。退火和延伸：60°C 60 秒。重复步骤 b 和 c，共进行 40 个循环。

使用实时 PCR 仪提供的软件分析定量 PCR 结果。或者，可以使用百分比输入法和下面显示的等式手动计算 IP 效率。使用这种方法，从每次免疫沉淀获得的信号表示为总输入染色质的百分比。

输入百分比 = 2% x 2(C[T] 2% 输入样本 - C[T] IP 样本)

C[T] = CT = PCR反应的阈值循环

IX. NG-测序库rary Construction

使用该试剂盒制备的免疫富集 DNA 样品可直接与 ChIP-seq 兼容。对于下游 NG 测序 DNA 文库构建，请使用与您的下游测序平台兼容的 DNA 文库制备方案或试剂盒。对于 Illumina® 平台上的测序，我们推荐用于 Illumina® 的 DNA 文库制备试剂盒（ChIP-seq、CUT&RUN）#56795 和其相关的索引引物 Multiplex Oligos for Illumina®（单索引引物）（ChIP-seq，CUT&RUN）#29580 或 Multiplex Oligos for Illumina®（双索引引物）（ChIP-seq，CUT&RUN）#47538。

建议：

对于转录因子或辅因子 ChIP-seq，使用至少 5 ng ChIP 富集的 DNA 并使用 10 个 PCR 循环扩增接头连接的 DNA。对于总组蛋白和组蛋白修饰，或输入样本，从 50 ng ChIP 富集的 DNA 开始，然后使用 6 个 PCR 循环扩增接头连接的 DNA。为所有目标构建 ChIP 富集 DNA 的文库类型，在不选择大小的情况下对接头连接的 DNA 进行清理。构建 DNA 文库后，使用安捷伦高灵敏度 DNA 试剂盒（安捷伦科技，目录号 G2938-90322）检查 DNA 文库是否存在接头二聚体（~140 bp），或使用 50-100 ng DNA 在 2% 琼脂糖 TAE 凝胶上进行琼脂糖凝胶电泳。如果 DNA 文库中存在接头二聚体，则重复 PCR 扩增材料的清理。文库的质量也可以使用 qPCR 和针对已知阳性和阴性目标位点的引物组来确认。阳性引物对仍应提供与比较相同的高信号如在对 ChIP 富集的 DNA 的原始 qPCR 分析中所见，为阴性引物。在最终清理和质量检查后，准备 2-10 nM 的最终纯化文库样本以进行高通量测序。附录 A：预期染色质产量

收获杂交时来自组织样本的连锁染色质，染色质的产量在不同组织类型之间可能存在显着差异。表向右亲提供了与 4 x 106 HeLa 细胞相比，25 毫克组织的预期染色质产量范围，以及预期的 DNA 浓度，如协议第 IV 节中所确定。对于每种组织类型，使用 Medimachine (BD Biosciences) 进行分解或 Dounce 匀浆器产生相似数量的染色质。但是，使用 Medimachine 分解组织处理的染色质通常比使用 Dounce 匀浆器分解组织处理的染色质具有更高的 IP 效率。强烈建议使用 Dounce 均质器来分解脑组织，因为 Medimachine 不能将脑组织充分分解成单细胞悬液。为获得最佳的 ChIP 结果，我们建议每次免疫沉淀使用 5 至 10 µg 消化的交联染色质；因此，某些组织每次免疫沉淀可能需要收获超过 25 mg。

组织/细胞总染色质产量预期 DNA 浓度脾脏 20-30 µg per 25 mg t问题 200-300 µg/ml肝脏 每 25 mg 组织 10-15 µg 100-150 µg/ml 肾脏 每 25 mg 组织 8-10 µg 80-100 µg/ml 大脑 每 25 mg 组织 2-5 µg 20-50 µg/ml 心脏 2 -5 µg 每 25 mg 组织 20-50 µg/mlHeLa 每 4 x 106 个细胞 10-15 µg 100-150 µg/ml 附录 B：染色质消化的优化

消化交联染色质 DNA 的最佳条件150-900 个碱基对的长度在很大程度上取决于微球菌核酸酶与消化中使用的组织数量或细胞数量的比例。以下是确定特定组织或细胞类型的最佳消化条件的方案。按照第 I、II 和 III 部分所述，从 125 mg 组织或 2 X 107 个细胞（相当于 5 个 IP 制备物）中制备交联细胞核。在第 III 部分的第 2 步后停止，然后按如下所述继续操作。将 100 µl 细胞核制备物转移到 5 个单独的 1.5 ml 微量离心管中并置于冰上。添加 3微球菌核酸酶原液微升至 27 微升 1X 缓冲液 B + DTT（酶的 1:10 稀释度）。向步骤 2 中的 5 个试管中的每一个添加 0 微升、2.5 微升、5 微升、7.5 微升或 10 微升的稀释的微球菌核酸酶，通过倒置试管数次混合并在 37°C 下频繁混合孵育 20 分钟。通过添加 10 µl 0.5 M EDTA 并将试管置于冰上停止每次消化。在微量离心机中以 13,000 rpm 离心沉淀细胞核在 4°C 下放置 1 分钟并去除上清液。在 200 µl 1X ChIP 缓冲液 + PIC 中重悬核沉淀。在冰上孵育 10 分钟。用几个脉冲对裂解物进行超声处理以破坏核膜。在脉冲之间将样品在湿冰上孵育 30 秒。细胞核完全裂解所需的最佳条件可以通过在超声处理前后在光学显微镜下观察细胞核来确定。使用 VirTis Virsonic 100 超声波匀浆器/超声仪在 3 组 20 秒脉冲后完全裂解 HeLa 细胞核使用 1/8 英寸探头设置为设置 6。或者，可以通过在 Dounce 匀浆器中将裂解物匀浆 20 次来裂解细胞核；然而，裂解可能不那么完整。通过在 4°C 下在微量离心机中以 10,000 rpm 离心 10 分钟来澄清裂解物。将 50 µl 的每种超声裂解物转移到新的微量离心管中。向每 50 µl 样品中加入 100 µl无核酸酶水、6 µl 5 M NaCl 和 2 µl RNAse A。涡旋混合并在 37°C 下孵育样品 30 分钟。向每个 RNAse A 消化的样品中添加 2 µl 蛋白酶 K。涡旋混合并孵育样品在 65°C 下 2 小时。从每个样品中取出 20 µl，并通过在带有 100 bp DNA 标记的 1% 琼脂糖凝胶上进行电泳来确定 DNA 片段大小。观察哪种消化条件产生的 DNA 在所需的 150-900 范围内碱基对（1 至 5 个核小体）。使用此优化方案产生所需大小的 DNA 片段的稀释微球菌核酸酶的体积相当于微球菌核酸酶原液体积的 10 倍，该原液体积应添加到一种免疫沉淀制备物（25 mg 分解的组织细胞或 4 X 106 个组织培养细胞）中以产生所需大小的 DNA 片段。例如，如果 5 µl 稀释的微球菌核酸酶在此方案中产生 150-900 个碱基对的 DNA 片段，则应在第 III 节中的染色质消化过程中将 0.5 µl 储备微球菌核酸酶添加到一个 IHC 制备物中。如果结果表明DNA 不在所需的大小范围内，然后重复优化方案，相应地调整每次消化中微球菌核酸酶的量。或者，可以改变消化时间以增加或减少 DNA 片段化的程度。附录 C：故障排除指南问题可能原因建议 1。消化染色质的浓度太低。添加到染色质消化中的细胞不足或细胞核在消化后未完全裂解。

如果染色质制备物的 DNA 浓度接近 50 µg/ml，则向每个 IP 添加额外的染色质以提供至少 5 µg/IP 并继续执行方案。

在交叉前计数单独的细胞板-链接以确定准确的细胞数和/或在超声处理前后在显微镜下观察细胞核以确认细胞核完全裂解。

2.染色质消化不足且片段太大（大于 900 bp）。

细胞可能过度交联。交联时间超过 10 分钟可能会抑制染色质的消化。

染色质消化中添加的细胞过多或微球菌核酸酶不足。

以固定时间执行时间进程甲醛浓度。将交联时间缩短至 10 分钟或更短。

在交联前对单独的细胞板进行计数以确定准确的细胞数，并参见附录 B 以优化染色质消化。

3 .染色质被过度消化，片段也被过度消化小（仅 150 bp 单核小体长度）。将染色质完全消化成单核小体长度的 DNA 可能会在 PCR 定量期间减弱信号，尤其是对于长度大于 150 bp 的扩增子。没有足够的细胞或添加到染色质消化中的微球菌核酸酶过多。在交联前对单独的细胞板进行计数，以确定准确的细胞数，有关染色质消化的优化，请参见附录 B。 4．输入 PCR 反应中没有产物或产物很少。

没有足够的 DNA 添加到 PCR 反应或条件不是最佳的。

PCR 扩增区域可能跨越无核小体区域。

没有足够的染色质添加到 IP 或染色质过度消化。

在 PCR 反应中添加更多 DNA 或增加扩增循环数。

使用来自交联和纯化的 DNA 优化实验引物组的 PCR 条件消化的染色质。设计不同的引物组并减少扩增子的长度大于 150 bp（参见第 VIII 节中的引物设计建议）。

为获得最佳 ChIP 结果，每个 IP 添加 5-10 µg 染色质。参见上面问题 1 和 3 的建议。

5．阳性对照组蛋白 H3-IP RPL30 PCR 反应中没有产物。

IP 反应中加入的染色质或抗体不足或 IP 孵育时间太短。

Protein G beads 染色质洗脱不完全。

务必添加 5- 10 µg 染色质和 10 µl 抗体用于每个 IP 反应，并与抗体一起孵育过夜，并在添加蛋白 G 珠子后再孵育 2 小时。

从蛋白 G 珠子上洗脱染色质的最佳温度为 65° C 经常搅拌以保持珠子悬浮在溶液中。

6．阴性对照兔 IgG-IP 和阳性对照组蛋白 H3-IP PCR 反应中的产物量是相等的。

IP 反应中添加的染色质过多或不足。或者，IP 反应中添加了过多的抗体。

添加的 DNA 过多加入 PCR 反应或过多的扩增循环。

向每个 IP 反应添加不超过 15 µg 染色质和 10 µl 组蛋白 H3 抗体。将每次 IP 的正常兔 IgG 的量减少至 1 µl。

在 PCR 反应中添加较少的 DNA 或减少 PCR 循环数。在 PCR 的线性扩增阶段分析 PCR 产物非常重要。否则无法准确测定起始DNA量的差异。

7．实验抗体-IP PCR 反应中没有产物。

没有足够的 DNA 添加到 PCR 反应。

没有足够的抗体添加到 IP 反应。

抗体不适用于 IP。

添加将更多 DNA 加入 PCR 反应或增加扩增循环数。

通常，IP 反应中会添加 1 至 5 µg 范围内的抗体；但是，确切的量在很大程度上取决于单个抗体。

增加添加到 IP 的抗体量。找一个备用抗体来源。

2011 年 12 月发布

2022 年 4 月修订

方案 ID：1184

特异性/灵敏度磷酸化- Stat1 (Tyr701) (D4A7) Rabbit mAb 仅在 Tyr701 磷酸化时识别 Stat1 蛋白的内源水平。物种反应性：

人、小鼠、大鼠

根据 100 预测反应的物种% 序列同源性：用于生产该抗体的抗原序列与此处列出的物种具有 100% 的序列同源性，但反应性尚未经过 CST 测试或证实有效。我们的抗体性能保证不涵盖对这些物种使用该产品.

猴子

来源/纯化

单克隆抗体是通过使用与人 Stat1 蛋白 Tyr701 周围残基相对应的合成肽对动物进行免疫接种而产生的。

p> 背景

Stat1 转录因子被激活以响应大量配体 (1)，并且是 e对 IFN-α 和 IFN-γ 的反应至关重要 (2,3)。 Stat1 在 Tyr701 的磷酸化会诱导 Stat1 二聚化、核易位和 DNA 结合 (4)。 Stat1 蛋白以一对同种型 Stat1α (91 kDa) 和剪接变体 Stat1β (84 kDa) 存在。在大多数细胞中，两种亚型都被 IFN-α 激活，但只有 Stat1α 被 IFN-γ 激活。 Stat1 的不当激活发生在许多肿瘤中 (5)。除酪氨酸磷酸化外，Stat1 还在 Ser727 位点通过 p38 丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK) 依赖性通路磷酸化，以响应 IFN-α 和其他细胞应激 (6)。最大程度诱导 Stat1 介导的基因激活可能需要丝氨酸磷酸化。

Heim, M.H. (1999) J Recept Signal Transduct Res 19, 75-120.Durbin, J.E. 等。 (1996) Cell 84, 443-50.Meraz, M.A. 等人。 (1996) Cell 84, 431-42.Ihle, J.N.等。 (1994) Trends Biochem Sci 19, 222-7.Frank, D.A. (1999) Mol Med 5, 432-56.Wen, Z. 等。 (1995) 单元格 82, 241-50。通路

探索与该产品相关的通路。

选择您的通路ErbB/HER SignalingGrowth And Differentiation Control by MAPKsIL6 SignalingInhibition of ApoptosisP38 MAPKs×Upstream / Downstream Proteins

STRING - 已知和预测的蛋白质-蛋白质相互作用。

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UniProt ID：P42224

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