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ImmunoChem/SGK Kinase Assay Kits, Type II/96 Assays/Kit/ICP0242
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SGK Kinase Assay Kits, Type II
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DESCRIPTION
Serum and glucocorticoid induced protein kinase(SGK) is a family of serine/threonine kinase. The SGK kinase assay kit (Type II) is a non-radioactive, homogenous, simple, immunoblot type assay. It is designed for the assay of SGK kinase on solid affinity matrices such as IP kinases or GST-SGKs on GSH beads. It is also useful for the activity analysis of SGK in the solution phase. The principle of the assay is simple. Purified SGK on the solid matrix will phosphorylate the kinase substrate-BSA conjugates (component C) in the solution, in the presence of ATP. The phosphorylated BSA-substrate is then analyzed using SDS-PAGE resolution and immunoblotting technique.
QUALITY CONTROL
The kits were tested using SGK 1, 2 and 3.Sensitivity is approximately 20 ng of active GST-SGK1/assay.
Assay for activity of GST-SGK1 using the type II kit (ICP0242)
A,250 ng; B, 125 ng; C,60 ng; D,30 ng; E, 15 ng; F, 0.00 ng
STORAGE STABILITY
Stable for 6 months at 4oC from date of shipment.
KIT COMPONENTS
A.Rabbit anti-phosphoSubstrate (anti-pSubstrate): 250 µg/mL in 200 µL of Tris acetate buffer, affinitypurified rabbit polyclonal, anti-phosphopeptide substrate (RPRAApTF-NH2) antibodies (catalog# ICP0190). The anti-pSubstrate antibodies recognize specifically the phosphorylated form of the substrate (RPRAApTF-NH2) but not the non-phosphorylated form (RPRAATF-NH2). Dilute the antibody to 0.25-0.5 µg/mL with antibody dilution buffer (B) for working solution (enough to prepare 100 mL of working antibody solution).
B.10 x Antibody Dilution Buffer (AbDB): Catalog# ICP0242b, 2x10 mL. Dilute 10 mL of AbDB to 100 mL with distilled water asworking buffer solution
C.BSA-Substrate Conjugates (BSA-Sub): Catalog# ICP0242c, 250 µg/mL in 500 µL kinase assay dilutionbuffer (D). Approximately 10 molecules of kinase substrate peptide (RPRAATF-NH2) were conjugated to one molecule of BSA. Apparent molecular weight of the major conjugate is 70-80 kDa. The apparent MW for the aggregated form is approximately 150 kDa (enough for more than 100 assays).
D.Kinase Assay Dilution Buffer (ADB): Catalog# ICP0242d, 10 mL. 20 mM MOPS, pH7; 25 mM beta-Glycerolphosphate; 1 mM EGTA; 1 mM sodium orthovanadate; 1 mM DTT; and 2 mM MgCL.
E.Adenosine Triphosphate (ATP): Catalog# ICP0242e, 2x2 mg, Dissolve in 2 mL kinase assay dilution buffer (D) as working solution. Aliquot as 100 µL/vial and store at -20oC if not used all at once.
Additional Reagents required but not Supplied:
1. Anti-rabbit Ig"s secondary antibodies.
2. PBSt washing buffer
3. 3% BSA or 3% skimmed milk as blocking buffer
4. All reagents and materials for SDS-PAGE, transfer materials, and signal generating system (such as BCIP/NBT or ECL)
PROTOCOL
Stage One: Preparation of kinase
1. Preparation of Kinase in Solution: Prepare the purifiedor partially purified (fractionated) kinase SGK in 10 µL of the kinase assay dilution buffer (component D) with the required concentration in microcentrifuge tubes. For inhibitor screening, serial dilutions (range from 1000 to 50ng/assay) of kinase should be tested for the optimal working concentration.
2. Preparation of the Immunoprecipitated Kinase:
Incubate anti-SGK (able to IP native kinase), or anti-GST, anti-HA (for tag-kinase) with 10 to 20 µL of protein A for 1 hr. Then wash away any unbound antibodies. Incubate the cell lysate in 250 µL of lysate buffer with the antibody-protein A complex in a rotor shaker at 4oC for 2 hrs. The user should select their own cell lysate buffer that contains protease and phosphatase inhibitors. The cell lysate sample should contain >20 ng of active SGK. Centrifuge and aspirate with PBSt twice then with kinase assay dilution buffer (D) twice. After aspiration, re-constitute the immunoprecipitated matrix in 10 µL of kinase assay dilution buffer (D).
3. Preparation of Kinase Purified with Affinity Matrix (GSH, Ni, maltose, etc.): The user should purify therecombinant kinases, such as GST-SGK, following their own protocol. 10-20 µL of affinity matrix/assay is recommended. Do a final wash and aspiration of the matrix with kinase assay dilution buffer (D) then re-constitute the aspired matrix with 10 µL of the kinase assay dilution buffer.
Stage Two: SGK kinase activity assay
1. Add 2.5-5 µL of the BSA-kinase substrate (component C) to the kinase sample prepared in stage one.
2. Add 5 µL of the ATP (component E) solution to initiate the kinase reaction. Incubate at 37oC for 60 min with constant shaking or hand shake every 5 min.
3. Stop the kinase reaction with 20 µL of SDS-sample loading buffer and boil for 2 min.
Stage Three: Running SDS-PAGE and transfer;
1. Prepare a 8% SDS-acryamide gel.
2. Run the SDS-PAGE until the dye-front is approximately 2-3 cm past entering the separation gel.
3. Perform the normal gel transfer to nitrocellulose membrane. The membrane only needs to cover between the top of separating gel and the distance to MW marker 60 kDa.
Stage Four: Immunoblotting.
1. Block the membrane with 3% BSA or 3% skimmed milk for 30-60 min
2. Wash the membrane twice with PBSt.
3. Incubate with 10 mL of anti-pSubstrate (component A), 0.25-0.5 µg/mL in antibody dilution buffer (component B) at room temperature for 2-4 hours, or 4oC overnight.
4. Wash the membrane with PBSt 4 times at 5 min intervals.
5. Incubate with anti-rabbit IgG secondary antibodies for 1-2 hours.
6. The user should select their own method (either colormetric or ECL system) for the signal generation.
Summary of the Assay:
1)Kinase reaction: BSA-RPRAATF-NH2 + ATP + Kinase --> BSA RPRAApTF-NH2
2)SDS-PAGE resolution and transfer
3) Specific immunoblotting for detection of the kinase product BSA-RPRAApTF-NH2 probed with anti- PRAApTF-NH2 (anti-pSubstrate)
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运输到中国口岸，最后由蚂蚁淘国内团队报关运输给客户...
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2019-02-12
UltraGROTM 细胞营养添加物具备以下优点：* 血清替代物* 非动物来源* 适用于初代培养及继代培养* 细胞倍增时间24小时* 节省时间及成本无血清/非动物来源 细胞营养添加物UltraGROTM 富含生长因子，经实验证能替代多种市售的细胞营养添加物在各种间充质干细胞的培养有极佳表现效果来自美国最先进制造技术每批次UltraGROTM皆经过间充质干细胞培养测试批次间稳定性高牛血清/动物蛋白添加物的缺点• 许多已知或未知的病原传染风险。• 异种 ... 查看更多
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2019-04-09
杭州百通生物技术有限公司在发布的人间充质干细胞培养基添加物, 50 ml供应信息，浏览与人间充质干细胞培养基添加物, 50 ml相关的产品或在搜索更多与人间充质干细胞培养基添加物, 50 ml相关的内容。 查看更多
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2021-07-26
北京裕恒丰科技有限公司在发布的间充质干细胞生长添加物供应信息，浏览与间充质干细胞生长添加物相关的产品或在搜索更多与间充质干细胞生长添加物相关的内容。 查看更多
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2019-04-09
上海伟进生物科技有限公司在发布的Gibco N-2 Supplement (100X), Liquid，N2添加物，17502-048（17502048）供应信息，浏览与Gibco N-2 Supplement (100X), Liquid，N2添加物，17502-048（17502048）相关的产品或在搜索更多与Gibco N-2 Supplement (100X), Liquid，N2添加物，17502-048（17502048）相关的内容。 查看更多
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2021-08-24
AimMany cultures obtained from a culture collection, such as ECACC, will arrive frozen and in order to use them the cells must be thawed and put into culture. 查看更多
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2021-09-22
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2019-02-10
北京裕恒丰科技有限公司在发布的滑膜细胞生长添加物供应信息，浏览与滑膜细胞生长添加物相关的产品或在搜索更多与滑膜细胞生长添加物相关的内容。 查看更多
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2021-07-27
少突胶质前体分化生长添加物是由北京裕恒丰科技有限公司代理或销售的ScienCell品牌的试剂，产品来源于美国ScienCell。北京裕恒丰科技有限公司是中国最权威的少突胶质前体分化生长添加物试剂销售服务商之一，在北京丰台区等地方销售少突胶质前体分化生长添加物试剂已经多年。生物在线为您提供众多企业少突胶质前体分化生长添加物仪器产品及图片，以便挑选到性价比高，合适的少突胶质前体分化生长添加物产品 查看更多
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2021-07-29
北京裕恒丰科技有限公司在发布的星形细胞生长添加物供应信息，浏览与星形细胞生长添加物相关的产品或在搜索更多与星形细胞生长添加物相关的内容。 查看更多
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2021-08-07
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2019-07-06
北京裕恒丰科技有限公司在发布的角质细胞生长添加物供应信息，浏览与角质细胞生长添加物相关的产品或在搜索更多与角质细胞生长添加物相关的内容。 查看更多
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2021-07-21
Long R3 IGF-I是人IGF-I(胰岛素样生长因子-I)的重组类似物，其在IGF-I全长氨基酸序列的第3位将谷氨酸变为精氨酸，并在N端添加一条长为13个氨基酸的肽。因此可见，Long代表N端加长，而R3代表第3位被精氨酸(R)所取代。 查看更多
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商品咨询
油漆的主要成分是什么? 123
2017-09-29
油漆中一种最重要的添加物是什么
日本药用辅料标准不一 管理重点是辅料给药途径123
捕风的汉子2012-07-31
国内好像买不到，不知道可以通知什么途径买到？非常感谢！
十六醇(药用辅料) 123
吕俊兰2021-07-28
急求日本《医药品添加物事项》中有关“十六醇”的资料，请各位大神帮帮忙
大学物理实验答案123
陡变吧WDU2017-09-29
最后三次是因为电池开始使用时电动势会比较大,再往后面电动势会比较趋于稳定,再取其平均值得出的数据误差较小!（前提是实验次数不可过多,应适量）
食品添加物??? 123
ynianx2017-09-29
请问哪里买的到？？重合磷酸盐:重含磷酸盐仅是他的学名商品名就各式各样了,品质向上剂,它含酸50％及酸上野制药株式会社HC"...
【说明书】HCoEpiC(人正常结肠上皮细胞)_培养基123
eastdevil2021-07-29
【求助】昆虫细胞培养基添加物 细胞技术讨论版论坛123
apple_amd2021-07-27
向大家求助一下，我要用Invitrogen公司的昆虫细胞培养基
grace粉末来配制，按说明书上的话加入碳酸氢钠外就不用加入
别的东西了，请问是否可以直接过滤用了：
在问，我们同一楼的另外一个实验室配制的时候加入了
水解乳蛋白和酵母粉，是否有这个必要，谢谢．在线，急等
grace粉末来配制，按说明书上的话加入碳酸氢钠外就不用加入
别的东西了，请问是否可以直接过滤用了：
在问，我们同一楼的另外一个实验室配制的时候加入了
水解乳蛋白和酵母粉，是否有这个必要，谢谢．在线，急等
【求助】关于细胞培养液添加物能用临床药品代替吗? 细胞技术...123
zwpp0002021-07-25
现在准备原代养一种人组织细胞，看文献上要用胰岛素、肝素钠，可是这些东西sigma的特别贵，而且只用一点，不知可否用临床上用的普通胰岛素、肝素钠注射液代替？请用过的朋友指点。
硼砂有毒,有人还用作“食品添加剂”,如何识别含硼砂的食物?123
小颜139qWp2017-09-29
食品安全法 -法律适用和法律责任
1、正确把握食品安全法与其他相关法律法规的关系。
食品安全法确立了当前和今后一个时期我国食品安全监管的基本原则、基本体制制度，对于其他相关法律法规具有指导和规范作用，其他相关法律法规的基本精神应当与食品安全法相一致。如农产品质量安全法，是规范农产品质量安全的专门性法律。在农产品生产加工领域，农产品质量安全法有明确规定的，适用农产品质量安全法，没有规定的，应当适用食品安全法。又如产品质量法，是规范和加强对产品质量的监督管理、明确产品质量责任的一般法。食品安全法则是规范食品安全的特别法。根据特别法优于一般法的原则，食品的安全监管应当适用食品安全法。关于乳品、转基因食品、生猪屠宰、酒类等食品安全管理，法律和法规另有规定的，适用其规定，没有规定的，适用食品安全法。
2、正确把握综合协调与分段监管的关系。
食品安全监管是一项复杂的系统工程，综合协调和分段监管是辩证统一的关系。一方面，没有强有力的综合协调，部门监管缺乏联动，就难以形成监管合力，具体监管中会出现缺位、错位和越位，容易埋下安全隐患。综合协调部门应当按照食品安全法赋予的六大职责，结合各环节监管实际，从制度上确保食品安全工作的连续性和统一性，使各部门形成合力，不断巩固食品安全工作成果。另一方面，没有职责分明的分段监管，就不能适应食品安全监管链条长、监管资源多的监管特点，不能有效调动各部门的积极性，也难以形成应对诸多复杂问题的合力，容易造成监管不力。因此，各监管部门既要按照食品安全法的分工要求，明确职责，理清思路，加强职责环节食品安全监管，又要在综合部门的统一协调下，发挥各自监管优势，为保障食品安全的共同目标而努力。
3、正确把握地方政府负总责与监管部门各负其责的关系。
食品安全法确立了县级以上地方人民政府对本行政区域食品安全统一负责的制度，目的是强化地方政府属地责任，加强对食品安全监管工作的领导，克服地方保护对食品安全监管的干扰。县级以上各食品安全监管部门，按照各自职责分工，依法行使职权，承担责任，是为了强调各自监管职能，建立健全权责一致的职责体系。地方政府负总责和监管部门各负其责是高度统一、相辅相成的关系，它要求各级政府必须把食品安全作为本地经济社会发展的重要任务，支持监管部门正确履行职责，创造良好的执法环境；也要求各监管部门恪尽职守，密切配合，责任到位，相互衔接，形成完整的监管链和责任追究体系。
4、正确把握食品生产经营者第一责任人与政府行政监管问责的关系。
食品安全法明确了食品生产经营者作为保证食品安全第一责任人的法定义务，更加严格地规范食品生产经营行为，促使食品生产者依据法律、法规和食品安全标准从事生产经营活动，在食品生产经营活动中重质量、重服务、重信誉、重自律，对社会和公众负责，保证食品安全，接受社会监督，承担社会责任。这一制度与政府行政监管问责制度并行不悖，共同形成一个科学合理、层次分明的完整的法律责任体系，为追究食品安全责任和补偿食品安全问题受害当事人提供了有力的制度保障。
1、正确把握食品安全法与其他相关法律法规的关系。
食品安全法确立了当前和今后一个时期我国食品安全监管的基本原则、基本体制制度，对于其他相关法律法规具有指导和规范作用，其他相关法律法规的基本精神应当与食品安全法相一致。如农产品质量安全法，是规范农产品质量安全的专门性法律。在农产品生产加工领域，农产品质量安全法有明确规定的，适用农产品质量安全法，没有规定的，应当适用食品安全法。又如产品质量法，是规范和加强对产品质量的监督管理、明确产品质量责任的一般法。食品安全法则是规范食品安全的特别法。根据特别法优于一般法的原则，食品的安全监管应当适用食品安全法。关于乳品、转基因食品、生猪屠宰、酒类等食品安全管理，法律和法规另有规定的，适用其规定，没有规定的，适用食品安全法。
2、正确把握综合协调与分段监管的关系。
食品安全监管是一项复杂的系统工程，综合协调和分段监管是辩证统一的关系。一方面，没有强有力的综合协调，部门监管缺乏联动，就难以形成监管合力，具体监管中会出现缺位、错位和越位，容易埋下安全隐患。综合协调部门应当按照食品安全法赋予的六大职责，结合各环节监管实际，从制度上确保食品安全工作的连续性和统一性，使各部门形成合力，不断巩固食品安全工作成果。另一方面，没有职责分明的分段监管，就不能适应食品安全监管链条长、监管资源多的监管特点，不能有效调动各部门的积极性，也难以形成应对诸多复杂问题的合力，容易造成监管不力。因此，各监管部门既要按照食品安全法的分工要求，明确职责，理清思路，加强职责环节食品安全监管，又要在综合部门的统一协调下，发挥各自监管优势，为保障食品安全的共同目标而努力。
3、正确把握地方政府负总责与监管部门各负其责的关系。
食品安全法确立了县级以上地方人民政府对本行政区域食品安全统一负责的制度，目的是强化地方政府属地责任，加强对食品安全监管工作的领导，克服地方保护对食品安全监管的干扰。县级以上各食品安全监管部门，按照各自职责分工，依法行使职权，承担责任，是为了强调各自监管职能，建立健全权责一致的职责体系。地方政府负总责和监管部门各负其责是高度统一、相辅相成的关系，它要求各级政府必须把食品安全作为本地经济社会发展的重要任务，支持监管部门正确履行职责，创造良好的执法环境；也要求各监管部门恪尽职守，密切配合，责任到位，相互衔接，形成完整的监管链和责任追究体系。
4、正确把握食品生产经营者第一责任人与政府行政监管问责的关系。
食品安全法明确了食品生产经营者作为保证食品安全第一责任人的法定义务，更加严格地规范食品生产经营行为，促使食品生产者依据法律、法规和食品安全标准从事生产经营活动，在食品生产经营活动中重质量、重服务、重信誉、重自律，对社会和公众负责，保证食品安全，接受社会监督，承担社会责任。这一制度与政府行政监管问责制度并行不悖，共同形成一个科学合理、层次分明的完整的法律责任体系，为追究食品安全责任和补偿食品安全问题受害当事人提供了有力的制度保障。
饲料中添加调味剂的好处123
2017-09-29
饲料添加剂主要分营养性添加剂和非营养性添加剂。营养性添加剂顾名思义，补充营养的，主要含各种微量元素维生素氨基酸什么的；非营养性的添加剂主要是改善饲料性状的如粘合剂，甜味剂等等，这些添加剂作用是增加动物取食量或改善饲料性状，使之容易保存运输或饲喂。
（技术讨论帖）关于细胞培养蛋白水解物的讨论_问答详情_添加物_细...123
biosky20132021-07-23
之前业界常用蛋白水解物，但是由于成份不明确，批次差异等不利因素。
现在不少文献和讲座都提到使用化学成份限定的supplement代替蛋白水解物，大家有什么经验可以分享或者交流的吗？
现在不少文献和讲座都提到使用化学成份限定的supplement代替蛋白水解物，大家有什么经验可以分享或者交流的吗？
【求助】DMSO ,丁酸钠这类添加物在生产上是否允许使用? 经验...123
jjxlt2021-07-21
想问下：DMSO，丁酸钠这类添加物在生产上是否允许使用？是否存在法规监管方面的问题？国外商业化生厂时有没有使用的例子
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