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请问有没有做过冻存（液氮或者-70度冰箱）组织的蛋白（WB)检测,之前看到提取蛋白说明书对冻存组织的提取不好，请问大家建议使用的什么试剂盒呢？谢谢！

具体看情况而定，实验室用的晶安生物的。

细胞冻存、解冻方法与细胞计数
一、细胞冷冻保存
1.材料：
生长良好之培养细胞、新鲜培养基、DMSO(SigmaD-2650)、无菌塑料冷冻保存管(Nalgene　5000-0020)、0.4％（w/v）trypanblue(GibcoBRL15250-061)、血球计数盘与盖玻片、等速降温机(KRYO10SeriesII)
2、冷冻保存方法：
（1）传统方法:冷存管置于4℃10分钟--->-20℃30分钟--->-80℃16～18小时(或隔夜)--->液氮槽vaporphase长期储存。
-20℃不可超过1小时，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。
（2）程序降温：利用已设定程序的等速降温机以-1～-3℃/分钟之速度由室温降至（-80℃以下）-120℃，再放在液氮槽vaporphase长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。
3、步骤：
（1）冷冻前24-48小时更换半量或全量培养基，使细胞处于指数生长期。
（2）配制冷冻保存溶液(使用前配制)：另取一离心管，加入培养基、血清，逐滴加入二甲基亚砜（DMSO）至20%浓度，即制成双倍的冻存液，置于室温下待用。
（3）离心收集培养之细胞，用加血清的培养基重悬起细胞，取少量细胞悬浮液(约0.1ml)计数细胞浓度及冻前存活率。
（4）取与细胞悬液等量的冻存液，缓慢逐滴加入细胞悬液，并晃动试管，制成细胞冻存悬液（DMSO最后浓度为5～10％），使细胞浓度为1～5×106cells/ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1～2ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测。严密封口后，注明细胞名称、代数、日期。然后进行冻存。
4、注意事项：
（1）欲冷冻保存之细胞应在生长良好(logphase)且存活率高之状态，约为80～90％致密度。冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。
（2）细胞在液氮中可长期冻存无限时间，而不会影响细胞活力；在-70度可保存数月。
（3）注意冷冻保护剂之品质。DMSO应为试剂级等级，无菌且无色(以0.22micron　FGLP　Telflon过滤或是直接购买无菌产品，如SigmaD-2650)，以5～10ml小体积分装，4℃避光保存，勿作多次解冻。Glycerol亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。本方法中先制备双倍冻存液，可避免DMSO直接加入时释放的热量对细胞的损伤。缓慢逐滴加入细胞悬液是使细胞逐步适应高渗，可降低细胞受损。DMSO可能引起部分白血病细胞株的分化，可换用10%甘油冻存。
（4）冷冻保存之细胞浓度：
①normalhumanfibroblast:1～3×106cells/ml
②hybridoma:1～3×106cells/ml，细胞浓度不要太高，某些hybridoma会因冷冻浓度太高而在解冻24小时后死去。
③adherenttumorlines:5～7×106，依细胞种类而异。Adenocarcinoma解冻后须较高之浓度，而HeLa只需1～3×106cells/ml
④othersUSPensions:5～10×106cells/ml，humanlymphocyte须至少5×106cells/ml。
（5）冷冻保护剂浓度为5或10％DMSO，若是不确定细胞之冷冻条件，在做冷冻保存之同时，亦应作一个backupculture，以防止冷冻失败。
（6）冻存可用10%～90%的血清，一般高浓度血清有助于维护细胞活力，此处介绍20%终浓度有利于细胞悬浮而少沉积（4度时），复苏存活率在80%～90%以上，对原代培养细胞，以90%血清冻存更为有效。

二、冷冻细胞活化
1、冷冻细胞之活化原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，导致细胞之死亡。
2、细胞活化后，约需数日，或继代一至二代，其细胞生长或特性表现才会恢复正常(例如产生单株抗体或是其它蛋白质)。
3、材料
37℃恒温水槽、新鲜培养基、无菌吸管/离心管/培养瓶、液氮或干冰容器
4、步骤：
（1）操作人员应戴防护面罩及手套，防止冷冻管可能爆裂之伤害。
（2）自液氮或干冰容器中取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉。
（3）将新鲜培养基置于37℃水槽中回温，回温后喷以70%酒精并擦拭之，移入无菌操作台内。
（4）取出冷冻管，立即放入37℃水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化，以70%酒精擦拭保存管外部，移入无菌操作台内。
（5）取出解冻之细胞悬浮液，缓缓加入有培养基之培养容器内(稀释比例为1:10～1:15)，混合均匀，放入CO2培养箱培养。取0.1ml解冻细胞悬浮液作存活测试。
（6）解冻后是否立即去除冷冻保护剂(例如DMSO或glycerol)，依细胞种类而异，一般而言，大都不需要立即去除冷冻保护剂。惟若要立即去除，则将解冻之细胞悬浮液加入含有5-10ml培养基之离心管内，离心1000rpm，5分钟，移去上清液，加入新鲜培养基，混合均匀，放入CO2培养箱培养。
（7）若不需立即去除冷冻保存剂，则在解冻培养后隔日更换培养基。
三、细胞计数与存活测试
1、原理：
（1）计算细胞数目可用血球计数盘或是Coultercounter粒子计数器自动计数。
（2）血球计数盘一般有二个chambers，每个chamber中细刻9个1mm2大正方形，其中4个角落之正方形再细刻16个小格，深度均为0.1mm。当chamber上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1mm2×0.1mm=1.0x10-4ml。使用时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104，即为每ml中之细胞数目。
（3）存活测试之步骤为dyeexclusion，利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。一般使用蓝色之trypanblue染料，如果细胞不易吸收trypanblue，则用红色之Erythrosinbluish。计算细胞活率：活细胞数/（活细胞数+死细胞数）×100%。计数应在台盼兰染色后数分钟内完成，随时间延长，部分活细胞也开始摄取染料；因为台盼兰对蛋白质有很强的亲和力，用不含血清的稀释液，可以使染色计数更为准确。
2、材料：
0.4%w/vtrypanblue(GibcoBRL15250-061)；Erythosinbluishstain；取0.1gramErythrosinbluish(SigmaE-9259)及0.05grampreservativemethylparaben(SigmaH-3647)溶于100mlCa++/Mg++freesaline；血球计数盘及盖玻片(Hemocytometerandcoverslip)；计数器(counter)；低倍倒立显微镜；粒子计数器(Coultercounter,CoulterElectronics)。白细胞稀释液（4%乙酸溶液）。
3、步骤：
（1）取50μl细胞悬浮液与50μltrypanblue(orErythrosinbluish)等体积混合均匀于1.5ml小离心管中。
（2）取少许混合液(约15μl)自血球计数盘chamber上方凹槽加入，盖上盖玻片，于100倍倒立显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞则为蓝色(或红色-Erythrosinbluish)。
（3）计数四个大方格之细胞总数，再除4，乘以稀释倍数(至少乘以2，因与trypanblue等体积混合)，最后乘以104，即为每ml中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线上，只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。
注：4大格细胞总数×稀释倍数×104/4=细胞数/ml；每一大格的体积=0.1cm×0.1cm×0.01cm=10-4ml
计数板计数时，最适浓度为5～10×105细胞/ml，此范围外计数误差偏大。高浓度细胞悬液，可取出部分作稀释或连续稀释后计数。
5、范例：
T75monolayerculture制成10ml细胞悬浮液，取0.1ml溶液与0.1mltrypanblue混合均匀于试管中，取少许混合液加入血球计数盘，计数四大方格内之细胞数目。
活细胞数/方格：55，62，49，59；死细胞数/方格：5，3，4，6；细胞总数=243
平均细胞数/方格=60.75；稀释倍数=2；
细胞数/ml：60.75×104×2（稀释倍数）=1.22×106；
细胞数/flask（10ml）：1.22×106×10ml=12.2×106
存活率：225/243﹦92.6%

冻存管存好 这样子便于试剂在合理的条件下储存 以后还能继续使用哈

本研究是一单基因遗传病的基因连锁定位及突变分析，现采集了外周血标本冻存（已分离出血浆，血细胞冻存－80度），择期拟提取基因组DNA做连锁分析，请问各位同道：用哪个公司的DNA试剂盒最好，谢谢！

RAW264.7细胞为小鼠单核巨噬细胞白血病细胞
培养基:1640+10%FBS
消化条件: 预冷PBS浸泡5－10Min
细胞正常形态为圆形,贴壁生长,生长速度较快,细胞难消化,消化时用预冷的PBS淋洗,然后浸泡5min,让后用枪轻轻吹起吹散收集离心,这个过程很关键,如果没有消化到位就吹打或消化过久,细胞次日贴壁就会分化,分化之后的形态是细胞两端长出尖尖的触角,细胞不再圆形贴壁,而是平铺向四周扩散生长。
所以你换培养基试试看，我养的挺好的！

我用bioteke的中量全血基因组DNA提取试剂盒（溶液型）提取冻存全血DNA：蛋白质沉淀液处理后上清呈褐色或淡红色，不是无色；在加入异丙醇后是褐色或淡红色絮状沉淀，不是白色絮状DNA沉淀。
我是参照试剂盒说明一步一步来的，请问这是什么原因？
是不是溶血啦，还是蛋白质没有沉淀完全，如何解决这一问题？
感谢啦！

阳离子脂质体转染试剂，保存温度2-8℃，如果放-20℃冻存后还能用吗？对转染效率影响究竟多大。。。

细胞冻存
1. 配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液；
2. 取对数生长期的细胞，去除旧培养液，用PBS清洗。
3. 去除PBS，加入适量胰蛋白酶（覆盖培养皿表面）把单层生长的细胞消化下来；
4. 离心1000rpm，5min；
5. 去除胰蛋白酶，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml；
6. 将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5 ml；
7. 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；
8. 冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/ min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h ，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。

我要提取血浆RNA，现在冻存于-80度，采集时已将血浆和血细胞分离，现在要抽提RNA，不知道还能提出来不？想问下用哪个protocol较好？还有提出后，如何保存，因为还要做RT-PCR，谢谢各位了！

本人要做ELISPOT，急求1、进口淋巴细胞分离液，Lymphoprep，或者NycoPrep1.077（无寡糖）2、Diaclone的ELISPOT配套试剂盒，3、荷兰U-CyTech公司推出的冻存液，专门针对做ELISPOT检测的专门针对于人的PBMC细胞的ELISPOT无血清培养基。各位高手帮帮忙，请指点如何买到上述产品，有相关联系电话更好.多谢！联系方式：zhangxy724@163.com。

我最近要做大鼠TNF-a的ELISA，可是试剂盒还没到，将大鼠脑组织进行-70度冻存，可以吗？可以放多久啊？谢谢各位大侠帮忙解答啊！！