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제품특징
□ 제품설명
pRI 201 DNA시리즈는 pRI 101시리즈 (Code 3262/3263)보다 더 높은 효율로 형질전환 식물에서 외래유전자를 발현시키기 위해 개량된 vector이다. Cauliflower mosaic virus (CaMV)의 35S protomer 하류에 ADH (AlcoholDehydrogenase) 유전자 유래의5’ 비번역 영역(5’-UTR) (translation enhancer 영역)를 탑재하였다. pRI 101시리즈 DNA를 기본으로
1) 종래의NOS (Nopaline Synthase) 유전자 유래 terminator를 HSP (Heat Shock Protein) 유전자유래 terminator로 바꾸는 것으로, pRI 101시리즈에비해 식물체에서 목적 유전자 산물의 고발현을 기대할 수 있다.
2) 또, HSPterminator 하류의 cloning site (MCS2)에 다른 유전자를 포함한 발현카셋트 (promoter＋enhancer＋목적 유전자+terminator)를 도입하여 하나의 벡터로 복수의 유전자를 형질 전환하는 것이 가능하다.
pRI 201시리즈에는 애기장대 ADH유래 5’-UTR(AtADH 5’-UTR)을 탑재하였다. pRI 201-AN DNA와 벼 ADH 유래 5’-UTR (OsADH 5’-UTR)을 탑재하였다. pRI 201-ON DNA의2종류가 있어 쌍자엽 식물에는 pRI 201-AN DNA, 단자엽 식물에는 pRI 201-ON DNA가적합하다. 또, 형질 전환시의 positive control로서 널리 이용되는 GUS(β-glucuronidase) 유전자를 각각의 벡터에 넣은 control vector (pRI201-AN-GUS DNA,pRI 201-ON-GUS DNA)도 판매하고 있다.
본 제품은 식물 형질 전환용 binary vector pRI 910 DNA (Code 3261)를기본으로 한 binary vector이며, Rhizobiumrhizogenes의Ri핵외 유전자 유래의 변이형 복제 기점 (Ri ori)을 가지고 있다
3) pUC계의 핵 외 유전자와 같은복제 기점 (ColE1 ori)을 가지고 있어, 대장균 내에서높은 copy수를 유지하며 또한, cloning site가식물의 selection marker에 비해 T-DNA의Right Border (RB) 측에 배치되어 있어 목적 유전자가 결여되는 일 없이 안정적으로 식물 염색체에 유전자삽입이 가능하게 되는 등, pRI 910 DNA가 가지는 특징도 보관 유지하고 있다.
※본 벡터는, 국립대학법인 나라 첨단 과학기술 대학원 대학부터 기술 및 시료의 제공을 받고, 다카라 바이오(주)가 제품화했습니다.
□ 용도
Binary vector법에 의해 Rhizobium (Agrobacterium)을매개로 식물 형질 전환을 위한 vector. 애기장대, 토마토, 담배 등의 쌍자엽 식물 (pRI 201-AN DNA, pRI201-AN-GUS DNA를 사용) 또는 벼 등의 단자엽 식물 (pRI 201-ON DNA, pRI 201-ON-GUS DNA를 사용)의형질 전환 및 외래 유전자의 고발현을 실현.
□ 내용 (농도: 각 0.5 μg/μl)
| pRI 201-AN DNA (TaKaRa Code 3264) | 10 μg |
| pRI 201-ON DNA (TaKaRa Code 3265) | 10 μg |
| pRI 201-AN-GUS DNA (TaKaRa Code 3266) | 10 μg |
| pRI 201-ON-GUS DNA (TaKaRa Code3267) | 10 μg |
□ 보존 -20℃
□ 길이
| pRI 201-AN DNA | 10,432 bp |
| pRI 201-ON DNA | 10,475 bp |
| pRI 201-AN-GUS DNA | 12,220 bp |
| pRI 201-ON-GUS DNA | 12,263 bp |
□ pRI 201 DNA 시리즈의 구조
ColE1ori： 대장균 유래 복제 기점 (대장균 유래)Ri ori： Rhizobium유래복제 기점 (Rhizobiumrhizogenes (Agrobacterium rhizogenes)유래)RB, LB： 식물염색체에 삽입되는 T-DNA 의border 서열 (Rhizobiumradiobacter (Agrobaceteriumtumefaciens) 유래)NOS promoter, NOS terminator： 식물체내의 유전자 발현을 위한promoter, terminator (Rhizobiumradiobacter (Agrobaceteriumtumefaciens) 유래)HSP terminator： 식물로의 유전자 발현을 위한 terminator (Arabidopsis thaliana 유래)GUS： β-glucuronidase 유전자 (대장균유래)NPT II： 식물체내의 selection marker 유전자 (대장균 유래)AtADH 5’-UTR, OsADH 5’-UTR： translation enhancer 영역 (Arabidopsis thaliana또는Oryza sativa 유래)35S promoter： 식물체내의 유전자 발현을 위한 promoter (CaMV 유래)NPT III： 대장균 및Rhizobium (Agrobacterium)의 selection marker 유전자 (kanamycin 내성) (Streptococcus faecalis유래)
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经过无数次的大鼠肝脏插针灌注，忍受过实验结果不理想的打击和折磨，今天终于成功了，特分享些相关图片以鼓励还在奋战中的网友们。
我的步骤：
1、16－22天小鼠颈椎脱臼法处死后，75%酒精浸泡30秒消毒，睾丸取出后置预冷PBS，40分钟（路上所需时间）后开始处理。
2、剔除白膜，剪碎睾丸。0.25%胰酶（含edta）1.5ml/个睾丸37°C消化30-50分钟，等体积DMEM/F12含10%FBS终止消化，1000r/MIN离心5分钟，弃上液。
3、加0.1%胶原酶消化30分钟，过200目网筛，1000r/MIN离心5分钟，弃上液。
4、DMEM/F12含10%FBS5ml重悬后转如培养瓶，入孵育箱37°C5%CO2培养。
请教各位，我到底是哪里有问题，是胰酶消化的时间长了吗？
最近在做黄体化颗粒细胞分离培养，但是注射器吸取大卵泡液或者从下颗粒细胞离心时就会凝固成果冻状，大家有碰到过这样的事情么？已经好几次了，一直是这样，大家给支个招吧
近期根据经验总结了原代肿瘤细胞分离培养的2个关键因素。
1、组织的活性：如果我们取的都是坏死的组织或者结缔组织，我相信任何方法都不可能分离出来活的细胞的。另外，取完的组织要冷藏存放，并且越早分离越好，最好在24h内，最久不要超过48h。
2、组织的消化：在组织消化前，组织剪的越碎越好（1mm3左右为宜），组织的大小决定了组织的消化时间，不同组织消化时间差别较大：例如肺癌在2h-2.5h；食管癌在1个多小时。
希望可以帮到各位研友，另外如果大家有更好的经验可以一起来讨论！
各位师兄师姐：
我近期负责的课题，需要进行人类血液淋巴细胞和DC细胞的分离和培养，但我在方面懂的不多，想求助这方面的大神们。后续我需要做RT-qPCR，western-blot、免疫荧光等实验，我应该去多少ml全血比较好？全血怎么保存？怎么进行分离？后续怎么培养和保存？
谢谢！
请大神前辈指点指点，已经研三了，实验很不顺利，再这样都要延期的节奏了。请问最近急性分离出来的大鼠心肌细胞很不耐钙，做膜片钳封接不上可能是什么原因造成的？谢谢了！
大概步骤如下：c57小鼠大概六七只，酒精浸泡后不处死取出，迅速打开胸腔取出心脏放入冰PBS冲洗。待心脏取出完毕，冲洗移入有PBS青霉素小瓶中用眼科剪剪成较小组织块。
之后加入0.1％胰酶消化（之前浓度为0.25％，活细胞数量更少。）吹打1min.放入孵箱中3min.弃去上清，加入∥型胶原酶（0.1％）吹打10Min，放入孵箱15Min。取出后加入1ml胰酶。吹打1Min后加入含血清F12培养液终止消化，800转离心5Min。之后取沉淀重悬种板。90Min差速贴壁法纯化心肌细胞。
48h后只有少量（个位数）细胞贴壁，呈三角形。
第一次用0.25％胰酶时离心后有大量鼻涕样物质。
第二次胰酶浓度减小后没有，但细胞沉淀少，且为半透明微白。是不是离心时间不够。
感觉细胞整体状态都不好，几次都没有大量心肌细胞，更不用说观察到心肌细胞搏动。
老师们能不能帮忙分析一下是哪里的原因呢。
有没有比较稳定的小鼠乳鼠心肌细胞分离步骤呢。
希望大神快点出现。
前辈们好，近期老板布置任务需要分离小鼠肝脏细胞，查了好多文献，都没有写胶原酶的cat#,只写sigma订购，想请教下，是否有人做过，可以提供下货号和使用方法吗？十分感谢。另外，文中还提到digitonin，如果有一起用到的话麻烦帮我查看下，谢谢。
我做的临床试验，就想简单检测PBMC细胞的凋亡，上流式检测，有啥检测效果好的步骤推荐一下，谢谢
