支原体菌株来源：M.ArgininiATCC23838精氨酸支原体M.FermentaneATCC19989发酵支原体M.SalivariumATCC23064唾液支原体M.HominisATCC23114人型支原体M.OraleATCC23714口腔支原体M.HyorhinisATCC29052猪鼻支原体其共同引物序列来自16s和23s保守区域外部引物为Ｆ15′-ＡＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＧＣＴＧＧＴＡＡＴ-3′Ｒ15′-ＧＴＴＣＡＴＣＧＡＣＴＴＴＣＡＧＡＣＣＣＡＡＧＧＣＡＴ-3′；内部引物为Ｆ25′-ＧＴＴＣＴＴＴＧＡＡＡＡＣＴＧＡＡＴ-3′Ｒ25′-ＧＣＡＴＣＣＡＣＣＡＡＡＡＡＣＴＣＴ-3′ＰＣＲ反应体系和条件：10×缓冲液(10ｍＭＴｒｉｓ-ＨＣｌ、500ｍＭＫＣｌ、20ｍＭＭｇＣｌ2、0.01%明胶)、ＰｒｉｍｅｒＦ1、Ｒ1、Ｆ2、Ｒ2的浓度为2ｎｍｏｌ/μＬ、2.5ｍＭｄＮＴＰｓ、Ｔａｑ酶、Ｈ2Ｏ、石蜡油覆盖反应温度和时间为:94℃/2ｍｉｎ预变性、94℃/30ｓ变性、55℃/1ｍｉｎ退火、72℃/1ｍｉｎ延伸循环30次后72℃延伸5ｍｉｎ第1次ＰＣＲ反应取模板10μＬ,第2次ＰＣＲ反应以第1次ＰＣＲ扩增产物为模板取1μＬ。下面是更详细的：污染测试——支原体：PCR方法原理：利用具特殊专一性之primers，经由PCR反应来复制mycoplasmaDNA。所用之primers来自mycoplasma之conserved16S-23SrRNA序列，由于此段spacer之序列依mycoplsma种类不同而不同，因此可依所复制之DNA大小及其restrictionfragment大小差异来作侦测与鉴定。特点：灵敏(e.g.0.1~1.6CFU/5ulsample)与快速(一天)。可侦测不易培养之mycoplasma(e.g.M.hyorhinis)。不需培养mycoplasma作为正反应对照组，避免可能之污染。缺点：PCR反应很灵敏，易有伪阳性结果。此方法尚在评估中，故结果仅作为参考和内部品管之一部份。材料与设备：ATCCmycoplasmadetectionkit:可作50～100reactions.提供1ststageprimermixture与2ndstageprimermixturepositivecontrolDNA(A.laidlawii;M.pirum)PCRreagents:Taqpolymerase(5U/ul)dNTP(dGTP,dCTP,dTTP,dATP,1.25mMeach)10xPCRbuffer(with1.5mMMgCl2)25mMMgCl2sterileddH2OMachine/Equipment：PCRthermalcycleragarose电泳设备DNA电泳胶体观察设备无菌PCR反应管无菌1.5ml微量离心管无菌2ul,20ul,200ul,1000ulTips/Pipetmans方法：此PCR反应是一种nestedPCR，包括2阶段PCR反应，1ststagePCR结束后，取其反应物作2ndstagePCR，然后取2ndPCR产物作agarosegelelectrophoresis，依DNAband之有无及片段大小来分析结果。结果：使用UVlight观察，并照相记录。不过应用较多还是巢式PCR方法：此PCR反应是一种nestedPCR，包括2阶段PCR反应，1ststagePCR结束后，取其反应物作2ndstagePCR，然后取2ndPCR产物作agarosegelelectrophoresis，依DNAband之有无及片段大小来分析结果。结果：使用UVlight观察，并照相记录。方法再详尽点：1ststagePCRreaction（totalvolume25ul）：测试样品(2ul/each)直接取样测试细胞之培养液。Positivecontrol:mycoplasmaDNA(A.laidlawii;M.pirum)Negativecontrol:ddH2OReactionmixture(23ul/each)10xPCRbuffer(含1.5mMMgCl2)2.5ul1ststageprimermixture0.5uldNTP(1.25mMeach)1.0lMgCl2(25mM)0.5ulTaqDNApolymerase(5U/ul)0.1ulddH2O18.4ulPCRprogram(1stPCR与2ndPCR相同)：使用PCRthermalcyclerstep1:denaturation:94℃30secstep2:denaturation:94℃30secstep3:annealing:55℃2minstep4:extension:72℃2min重复3.1.3.2至3.1.3.4步骤30cyclesstep5:finalextension72℃5min2ndstagePCRreaction（totalvolume25ul）测试样品：1ststagePCRproduct（1ul/each）。Reactionmixture(24ul/each)10xPCRbuffer(含1.5mMMgCl2)2.5ulndstageprimermixture0.5uldNTP(1.25mMeach)1.0ulMgCl2(25mM)0.5ulTaqDNApolymerase(5U/ul)0.1ulddH2O19.4ulPCRprogram同3.1.3；使用PCRthermalcycler胶片电泳分析胶片(2.0%)置备:将2gagarose溶于100ml(1x)TAEbuffer。电泳液：(1x)TAEbuffer（Tris-acetate/EDTAelectropheresisbuffer）选择100~500bpDNAsizeMarker：取100bpladderMarker5ul(25ng/ul)取10ul2ndstagePCR产物分析，各加入2ul(6x)loADIngdye。进行电泳分离100V,25min。胶片染色：ethidiumbromide染色10min，H2O退染10mim。（EtBr为致癌物质，请戴手套并小心操作）结果：使用UVlight观察，并照相记录。FigureAgarosegelelectrophoresisofthe2nd-stagePCRProductsfromeightcommonlyencounteredMycoplasmaandA.laidlawiiSpecies.(fromATCCmycoplasmadetectionkit)
