酵母的高效转化 1.接种5ml液体YPAD或10mlSC,30℃下振荡培养过夜。 2.计数过夜培养物细胞密度,以最终5×106个/ml的细胞密度接种50mlYPAD培养液。 3.置30℃,200r/min振荡培养至2×107个细胞/ml,通常需要3~5小时,该培养物的细胞足够供十次转化用。 4.用50ml无菌离心管以3000g(2500r/min)离心5分钟,收获细胞。 5.弃培养液,把细胞悬浮在25ml无菌水中,再同上离心。 6.弃水,把细胞悬浮在1ml的100mmol/L醋酸锂中,转悬浮物到一个无菌1.5ml离心管。 8.悬浮细胞到最终500μl体积其中大约含400μl的100mmol/L醋酸锂。 9.将1ml单链载体DNA样品煮沸5分钟,快速在冰水中冷却。 10.振荡细胞悬浮液,取50μl样品加到标记的离心管中,离心沉淀细胞,用微量取样器除去醋酸锂。 11.基本“转化混合液”由下列成分组成,小心按下列顺序如下: 240μlPEG(50%w/v) 36μl1.0mol/L醋酸锂 25μl单链载体DNA(2.0mg/ml) 50μl水和质粒DNA(0.1~10μg) 12.剧烈振荡每个反应管每个反应管直到细胞完全混匀,通常需要1分钟左右。 13.置30℃保温30分钟。 14.置42℃水浴中热激20~25分钟。 15.以6000~8000r/min离心15秒,用微量移液器除去转化混合液。 16.吸0.2~1.0ml无菌水加到每个反应管中,用移液器上下轻轻抽提以悬浮沉淀。 17.用等份的200μl转化混合液涂选择平板。