Description: KnockdownefficacycomparisonofGenMuteTransfectionReagent(upperpanel)vs.Dharmafect4siRNATransfectionReagent(middlepanel)andLipofectamine2000(lowerpanel)onHEK293cells.siRNAtargetingrenillaluciferaseatdifferentfinalconcentrationsrangingfrom0.5to20nMwasco-transfectedwithrenillaluciferasegene(0.5µgofpRL-CMVDNAperwell)bytheabovethreetransfectionreagentspermanufacturers"protocolsintoHEK293cellsgrowingona24-wellplate.Renillaluciferaseactivitywasdetermined24hafterpostco-transfectionwithrenillaluciferasedeterminationsystem(Promega).Theluminescencewasmeasuredfrom5.0µloflysateduring10sintegrationwithaluminometer(BeckmanCoulterLD400).Luciferaseactivitywasexpressedaslightunitsintegratedover10s(RLU)andnormalizedpermgofcellproteinbyusingtheBCAassay.Theerrorsbarsrepresentstandarddeviationderivedfromtriplicateexperiments.Luciferase-silencingefficiencywascalculatedrelativetountreatedcells.WhileGenMuteandDharmafect4reagentsdeliveredsignificantgenesilencingfrom1.0nMofrenillaluciferasesiRNA,lipofectamine2000gavegoodknockdownonlyafter30nM(datanotshown).
GenMuteReagentisanovelbiodegradablenon-LiposomalsiRNA/miRNA&DNAdeliverytool.WithourproprietarypHDependentConformationalChange(PDCC)technology,thebiodegradabletransfectionreagentwasformulatedbyadditionofpre-screenedhydrophobicgroupstoitssidechain,makingGenMuteReagentaversatileandmostpowerfulgenedeliverytoolinthemarket.GenMuteReagenthavebeenvalidatedtoeffectivelyandreproducIBLytransfectsinglesiRNA/miRNAorco-transfectDNA/siRNAorDNA/miRNAtovarietyofmammaliancells.
Size&content:
-GenMuteReagent,1.0mL,sufficientfor~2,000reactionsbasedontransfecting5.0pmolsiRNAormiRNAmimicsin24-wellplate.
-GenMuteTransfectionBuffer(5x),formulatedformaximaltransfectionefficiency,8.0mLtomake40mLworkingsolution.
Applications:
-SinglesiRNAtransfectionorDNA/siRNAco-transfectiontovarietyofmammaliancells.
-SinglemiRNA,miRNAmimicsorinhibitorstransfectionorDNA/miRNAorDNA/miRNAmimicsco-transfectiontovarietyofmammaliancells.
Storage:
Storeat4°CforGenMuteReagentandRTforGenMuteTransfectionBuffer(5x). Ifstoredproperly,theproductisstablefor12monthsorlonger.
Advantages:
-Excellentsilencingatlowconcentrationswithonly1.0nMsiRNA/miRNAmimics
-Minimizingnon-specificandofftargeteffectsinthecell
-Onetubereaction
-Bestforbroadmammaliancells
-Verylowcytotoxicity
-Veryaffordable
ComparisonsofSilencingEfficacyofGenMutesiRNA&DNATransfectionReagentwithBrandNameProducts
ExcellentsilencingofendogenouslyexpressedKIF11(alsoknownasEg5)inHEK293cellswith0.5µlofGenMutereagentand5.0pmolEg5siRNAperwellof24-wellplate.KIF11(alsoknownasEg5)encodesamotorproteinthatbelongstothekinesin-likeproteinfamilyinvolvedinchromosomepositioningandbipolarspindleformationduringcellmitosis.AreductioninKIF11levelscausesmitoticarrest.GenMutereagenteffectivelydeliversEg5siRNA(final10nM,rightpanel)toHEK293cellsatonly0.5µlperwellof24-wellplatevs.negativecontrol(final10nM.leftpanel).Comparedwithnegativecontrol(leftpanel),phenotypeof"rounded-up"293cellswerevisualized24hoursposttransfection(rightpanel)withaNikonmicroscope.
GenMuteTransfectionReagentknockeddownendogenouslaminA/CgeneexpressioninHelacells.AsiRNAtargetinglaminA/Cgene(rightpanel)andashamsiRNA(leftpanel)wereintroducedintoHelacells(final1.0nM)byGenMuteTransfectionReagent.LaminA/Cgenesilencingwasmonitored24hposttransfectionbyimmunofluorescence.LaminA/CwasprobedwithamousemonoclonallaminA/CspecificantibodyfollowedbyadditionofFITC-conjugatedanti-mouseantibodies.QuantitativeanalysisshowedthatlaminsiRNAat1.0nMdeliveredbyGenMuteTransfectionReagentknockeddown94%endogenouslyexpressedlaminA/CinHelacells.
DataSheet&Protocol
-AProtocolforsiRNATransfectionandDNA/siRNACo-Tranafection
-AProtocolformiRNAMimicsTransfectionandDNA/miRNACo-Transfection
-AProtocolforDNATransfectiontoMammalianCells
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脂质体介导法
实验原理
上图所示是脂质体介导转染的示意图，它显示了外源质粒进入细胞的一般过程。
外源基因进入细胞主要有四种方法：电击法、磷酸钙法和脂质体介导法和病毒介导法。电击法是在细胞上短时间暂时性的穿孔让外源质粒进入；磷酸钙法和脂质体法是利用不同的载体物质携带质粒通过直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因进入细胞；病毒法是利用包装了外源基因的病毒感染细胞的方法使得其进入细胞。但是由于电击法和磷酸钙法的实验条件控制较严、难度较大；病毒法的前期准备较复杂、而且可能对于细胞有较大影响；所以现在对于很多普通细胞系，一般的瞬时转染方法多采用脂质体法。
利用脂质体转染法最重要的就是防止其毒性，因此脂质体与质粒的比例，细胞密度以及转染的时间长短和培养基中血清的含量都是影响转染效率的重要问题，通过实验摸索的合适转染条件对于效率的提高有巨大的作用。
上图是本次实验采用的脂质体中阳离子组分的结构的示意图。
本次实验采用的脂质体是promega公司的TransFast脂质体试剂，它是一种阳离子脂质体和中性脂质体的混合物，是对于本次实验中采用的293T细胞优化的转染试剂。
目标蛋白对细胞有毒性，导致细胞死亡；
转染试剂以及DNA用量信息需要优化，否则对细胞具有伤害；
细胞贴壁转染之后没有正常换液。
建议：考虑对目标蛋白进行截短构建、尝试其他细胞系统；摸索转染试剂以及DNA用量信息，如果转染试剂毒性太大，可以考虑尝试义翘转染试剂sinofection；对转染后的细胞进行换液处理，如果细胞状态感觉不够理想，可以考虑添加一些血清来帮助细胞恢复健康。
以上所有分析、建议的前提是，细胞培养、无菌操作等等都没有问题。祝顺利，加油~
“转化”是指含外源基因的重组质粒（载体）将外源基因直接导入原核细胞（如细菌）；
“转导”指通过重组病毒载体将外源基因导入真核细胞或原核细胞；
“转染”指重组质粒载体或游离核苷酸在脂质体等介导下进入真核细胞；
“感染”在基因转移实验中强调重组病毒载体入侵受体细胞的过程。
在使用这4 个名词时， 应仔细分析基因转移实验的四要素——转移物、载体、介导方法、受体细胞类型，而正确区 分载体和受体细胞类型是辨析的关键点。当载体是重组质粒时，如受体细胞是原核细胞应使 用“转化”，如受体细胞是真核细胞则使用“转染”；当载体是重组病毒时，如强调转移物进 入受体细胞应使用“转导”，如强调重组病毒载体进入受体细胞的过程则使用“感染”。
我刚开始做转染，悬浮细胞，分别做过表达和敲减，看了很多文献，大都没有提及转染后是用转染的这同一批细胞同时做pcr，wb，cck8，凋亡，细胞周期；还是说这次转染只做pcr或wb，再转染一次做cck8或细胞周期。剩下的功能试验均同前，转染一次做一次？我养的是悬浮细胞，转染后做cck8这些功能试验前需要离心换液吗？跪谢解答！
其次要看下你选择单位的规模如何，做的比较好的，还是上海这边的，你可以看下基尔顿生物，原代细胞培养，动物造模，整体课题外包。
