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非整倍体无限细胞系和癌细胞株中,仍然存在不同细胞亚群,它们的功能和生长特点有些差异,其中有些亚群细胞对培养环境有较大的适应性和具有较强的独立生存能力,细胞集落率高。纯化细胞群来自一个共同的祖细胞,细胞遗传性状、生物学特性相似,利于实验研究。原代培养细胞和二倍体有限细胞系,细胞集落率很低。细胞集落化培养之前,应先测定细胞集落形成率,以了解细胞在极低密度条件下的生长能力。
目前认为仅有肿瘤干细胞具有形成集落的能力,集落抑制率常用于抗癌药物敏感试验、肿瘤放射生物学试验。
集落抑制率=(1-(实验组集落形成率/对照组集落形成率))×100%
(一)原理
细胞集落形成率 单个细胞在体外增殖6代以上,其后代所组成的细胞群体,称为集落或克隆。每个克隆含有50个以上的细胞,大小在0.3-1.0mm 之间。集落形成率表示细胞独立生存能力。常用方法有平板集落形成试验、软琼脂集落形成试验。
(二)实验用品
1.材料:Hela细胞。
2.器材:(直径 60mm )培养皿、细胞记数板、烧杯、吸管、离心机、离心管、废液瓶、倒置显微镜、二氧化碳培养箱、超净工作台、水浴锅。
3.试剂:Giemsa染液、0.25%胰蛋白酶消化液、血清细胞培养液、安尔碘、琼脂。
(三)方法
1.平板克隆形成试验
本法适用于贴壁生长的细胞,包括培养的正常细胞和肿瘤细胞。
(1)对指数生长期细胞,采用常规消化传代方法,制成细胞悬液。
(2)细胞悬液反复吹打,使细胞充分分散,单个细胞百分率应在95%以上。细胞记数,并用培养基调节细胞浓度,待用。
(3)根据细胞增殖能力,将细胞悬液倍比稀释。一般按照每皿含50、100、200个细胞的浓度分别接种5ml细胞悬液到培养皿(直径 60mm )中,以十字方向轻轻晃动培养皿,使细胞分散均匀。
(4)培养皿置 37℃ 、5%CO2中培养2~3周,中间根据培养液pH变化适时更换新鲜培养液。
(5)当培养皿中出现肉眼可见克隆时,终止培养,弃去培养液,PBS液小心浸洗2次,空气干燥。甲醇固定15分钟,弃甲醇后空气干燥。用Giemsa染液染色10分钟,流水缓慢洗去染液,空气干燥。
2.软琼脂集落形成试验
本法适用于非锚着依赖性生长的细胞,如骨髓造血干细胞、肿瘤细胞株、转化细胞系。利用琼脂液无粘着性又可凝固的特性,将肿瘤细胞混入琼脂液中,琼脂液凝固使肿瘤细胞置于一定位置,琼脂中肿瘤细胞可能向周围作全方位的移动,因此可以用来检测肿瘤细胞的主动移动能力。肿瘤细胞在适宜培养基中又可以增殖,从而可以测定肿瘤细胞克隆形成率。造血系统软琼脂集落形成试验方法相同,主要用于有关细胞分化的研究,但使用培养基不同。
(1)同上(1)~(3)步骤。
(2)调整细胞悬液密度为1×103个/ml细胞。
(3)制备底层琼脂,完全溶化的5%琼脂和 37℃ 左右预温的新鲜完全培养液以1:9比例在 40℃ 均匀混合,加入培养皿(直径 60mm )中,每皿含0.5%琼脂培养基2ml,室温下琼脂完全凝固。
(4)制备上层琼脂,取 37℃ 不同密度梯度(按照每皿含50、100、200个)的细胞悬液1.5ml移入小烧杯中,加入 40℃ 、5%琼脂等体积混匀,即成0.25%半固体琼脂培养基。配好的半固体琼脂培养基立即加入铺有底层琼脂的培养皿中,室温下琼脂凝固。 37℃ 、5%CO2静置培养2-3周。
(四)实验结果
1.定期观察细胞培养过程中集落的形成。
2.显微镜下计数大于50个细胞克隆数,然后按下式计算集落形成率:
集落形成率(%)=(集落数/接种细胞数)×100
(五)注意事项
1.琼脂对热和酸不稳定,如果反复加热,容易降解,产生毒性,同时琼脂硬度下降。故琼脂高压灭菌( 10磅 15分钟)后按一次用量进行分装。
2.细胞悬液中,细胞分散度>95%。
3.软琼脂培养时,注意琼脂与细胞混合时温度不要超过 40℃ ,以免烫伤细胞。
4.接种细胞密度不宜过高。
5.细胞在低密度条件下培养,生存率明显下降,无限细胞系和肿瘤细胞株克隆形成率一般在10%以上。但初代培养细胞和有限细胞系仅为0.5~5%,甚至为零。为提高集落形成率,必要时在培养基中添加胰岛素、地塞米松等促细胞克隆形成物质。
①持续分裂细胞,又称周期性细胞, 即在细胞周期中连续运转的细胞。机体内某些组织需要不断的更新,组成这些组织的细胞就必须通过不断分裂产生新细胞。此类细胞的分裂周期非常正常, 有丝分裂的活性很高。如性细胞(包括卵母细胞和精原细胞),它们要不断地产生配子; 造血干细胞需要不断地产生红细胞和白细胞;上皮基底层细胞需要通过分裂不断补充表面老化死亡的细胞; 植物的根茎尖端细胞需要通过分裂进行生长等都是具有正常周期的持续分裂细胞。
②终端分化细胞, 即永久性失去了分裂能力的细胞,它们不可逆地脱离了细胞周期, 但保持了生理活性机能。这些细胞都是高度特化的细胞, 如哺乳动物的红细胞、神经细胞、多形性白细胞、肌细胞等, 这些细胞一旦分化,就永远保持这种不分裂状态直到死亡。
③G0细胞,又称休眠细胞,暂时脱离细胞周期,不进行DNA复制和分裂, 也称静止细胞群。但这些细胞可在某些条件的诱导下重新开始DNA合成, 进行细胞分裂。如肝细胞, 外科手术切除部分肝组成后可以诱导进入细胞分裂。淋巴细胞可通过与抗原的相互作用诱导增殖。在胚胎发育早期(卵裂期),所有的细胞均为周期性细胞, 以后随着发育成熟, 某些细胞进入了GO期, 某些细胞分化后丧失分裂能力。到成体时,只有少数细胞处于增殖状态, 它们的增殖仅作为补充丢失的细胞, 或对外界刺激的反应。
郎格罕斯细胞组织细胞增生症(Langerhanscellhistiocytosis)或郎格罕斯细胞病(Langerhans#39;celldisease)又称组织细胞增生症X(HistiocytosisX),为一组少见的,以郎格罕斯细胞增生为主的疾病.本病的病因和发病机制尚不清楚,有人认为是反应性疾病,而非真性肿瘤.也有人认为本病是免疫系统异常所致,但通过PCNA免疫组化可见较多的阳性细胞,且病变中常见核分裂象故认为是增生性疾病,可能为肿瘤性增生。这种病要看医生。
比如用CD3、CD28刺激,除了这个还有什么方法吗?增殖!
and还想问问用CD3、CD28刺激是不是所有T细胞都能增殖?
刚入实验坑的新人一枚,有关凋亡和增殖的检测方法看来看去有好多啊,我想问下大神们目前用的最多的有关细胞凋亡和增殖的检测方法分别是什么?哪些相对更加精确一些,而哪些只是粗略的看一下啊??
细胞增殖是评价细胞活性、代谢、生理和病理状况的重要指标。检测
1.MTT。
MTT法检测原理:活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜(Formazan),而死细胞无此功能。用DMSO溶解甲臜后在490nm波长处测定其吸光度值,可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内,MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
MTT法检测细胞增殖算是比较常用的方法了,价格便宜,不过其甲瓒产物不溶于水,需有机溶剂溶解后方可检测,其增加了工作量,同时对结果的准确性产生影响,重复性较差吧。
2.CCK8
CCK8检测原理:CCK8中的主要成分WST®-8能被细胞内的脱氢酶还原为水溶性的橙黄色甲臜,生成甲臜的量与细胞数成正比,可间接测定活细胞数量。
相比较于MTT而言,CCK8的灵敏度要更高,其生成的甲瓒产物溶于水,重复性和准确性上要优于MTT法,对于细胞的毒性较小,不过价格也是相比MTT要贵一截。
3.通过标记DNA检测细胞增殖的常用的大概是Brdu和EDU用的比较多。
Brdu是一种胸腺嘧啶核甘类似物,可代替胸腺嘧啶在DNA合成期(S期)参入正在复制的DNA中,之后我们通过抗Brdu的抗体与荧光二抗快速检测细胞的DNA复制活性。EDU也是一种胸腺嘧啶核苷类似物,能够在DNA复制时期代替胸腺嘧啶(T)渗入正在合成的DNA分子中,基于Apollo®荧光染料与EdU的特异性反应即可直接并准确地检测出DNA复制活性,类似于一种化学反应吧,而无需抗原抗体结合。
相比较而言,Brdu或者edu更适合用于siRNA、miRNA、小分子化合物及其药物筛选等。同时Brdu或者EDU也适用于小鼠,大鼠及其他动物模型的各种组织器官(血管除外)的细胞增殖检测。关于Brdu和EDU的各自优缺点可以参考下帖。具体问题具体分析吧,目前来看EDU检测越来越普遍吧。关于Brdu检测细胞增殖,一种可以使用免疫荧光通过Brdu-FITC与DAPI双染判断细胞的增殖情况。
一般对于细胞来说都是免疫荧光的常规步骤吧,只是需要一步盐酸进行变性DNA和中和。
1.细胞铺板24孔板或者6孔板。可以进行加药处理细胞
2.加入一定终溶度的BrdU继续培养一定的时间。随后弃去孔内溶液,PBS润洗3次。
3.4%多聚甲醛固定细胞30min,PBS再润洗3次
4.0.1%TritonX-100处理细胞15min后,接着PBS润洗3次
4。接着2MHCl处理30min,再加入0.1M的硼酸中和10min,PBS润洗3次。
5.滴加5%BSA室温封闭30min,弃去液体,滴加1:200稀释的BrdU一抗,4℃孵育过夜。
6.次日,弃去一抗,PBS润洗5次,在避光条件下,滴加1:50稀释FITC标记二抗,室温孵育1h后,PBS再润洗5次。
7.pbs洗5遍,滴加DAPI溶液,室温孵育5到10分钟,PBS洗5遍。
8.荧光显微镜观察。拍照。只是需要注意的是细胞固定这一块吧,如果细胞固定不好的话,细胞容易连在一起而无法分清S期和M期等。同时容易造成细胞碎片吧。
附张失败的图片。
文献中完美的图片:
图片来源:EthanolinducescytostasisofcorticalbasalProgenitors
4.关于EDU,目前一般都是拿试剂盒做的,操作简单方便。步骤相比Brdu而言,少了DNA变性,无需抗体孵育等环节。
细胞分裂间期分为G1期S期和G2期 G1期的特点:G1期是从上次细胞增殖周期完成以后开始的。G1期是一个生长期。在这一时期主要进行RNA和蛋白质的生物合成,并且为下阶段S期的DNA合成做准备。如合成各种与DNA复制有关的酶,线粒体、核糖体等都增多了
细胞增殖是生物体的重要生命特征,细胞以分裂的方式进行增殖。单细胞生物,以细胞分裂的方式产生新的个体。多细胞生物,以细胞分裂的方式产生新的细胞,用来补充体内衰老或死亡的细胞;同时,多细胞生物可以由一个受精卵,经过细胞的分裂和分化,最终发育成一个新的多细胞个体。必须强调指出,通过细胞分裂,可以将复制的遗传物质,平均地分配到两个子细胞中去。可见,细胞增殖是生物体生长、发育、繁殖和遗传的基础。
原核生物比如大肠杆菌促进增殖药物还不如提供更好的营养条件、足够的环境;抑制类药物如上。
根据细胞种类不同,可能需要不同成分的培养液,来达到促进/抑制的作用
如题。以及下面问题:
要检测转基因小鼠(不知道)和正常鼠细胞免疫的改变(T细胞)需要做那些实验?

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