材料

—10-0缝合线（Ethicon)

一工具：Jeweler’s镊子（#4或5;DumontMedical);精细持针器或45°角镊子(如SS/45;DumontMedical);弹簧剪刀；顶端精细的咬骨钳（如#16000-14;FinescienceTools,NorthVancouver,B.C.,Canada)一止血用可吸收性明胶海绵（Gelfoam;Upjohn,Kalamazoo,Mich.，USA)_散瞳剂（如1%盐酸环戊酮，Alcon)

一大鼠头部固定器（#320型）和Universal立体定位仪（#310型；DavidKopf,Tujunga,Calif.,USA)

一骨蜡（骨出血止血用）

—电动骨钻（Dremel,Racin,Wis.,USA)

一抗生素药膏（如polysporin)

一皮下注射用针（26G或更小）用于打开软脊膜

—微型玻璃吸管

—10)nlHamilton注身寸器（#710;Hamilton,Reno,Nev.，USA)

步骤

本章节的所有步骤都是在腹膜腔内注射麻醉（如Ketamine,Xylazine)下实施，可以常规应用于仓鼠和大鼠。这些步骤也可以用于小鼠，但在技术上更困难些，尤其是视神经的周围神经移植。

一、自体同源腓总神经移植物的获取（图13-1)

神经显露

动物俯卧，腿部伸展，用胶纸固定住脚。沿大腿长轴作一皮肤直切口，从臀部一直延伸到膝盖下部。在臀肌和胭窝肌附着于股骨的部位切开，用缝线穿过肌肉后向内侧牵引以显露出下面的坐骨神经。整条坐骨神经都能取用，但为了降低术后腿部无力和足部自残的危险性，一般取用排总神经（commonperonealnerve)而保留腔神经（tibialnerve)。动物如发生足部自残的现象应予以处死。

腓总神经移植物远端的切断和游离

解剖始于远端，在腓总神经的2个主要分支（即腓深和腓浅神经）于膝下方即将进入小腿肌处，切断该二分支（图13-1)。最好用左手持精细镊（如jeweler，s镊子，井4or5;DumontMedical)夹住腓总神经，右手持顶端精细的弹簧剪刀将之游离、剪断。

注意解剖时神经不宜夹之过紧，另外，为了防止神经坏死，应定时地用生理盐水湿润神经。

腓总神经位于大腿远端的一条大静脉下面，为了防止出血，最好绕开这条血管，并从静脉下方将游离的腓总神经抽出。如果该静脉出血，则用一小块明胶海绵（Gelfoam;Upjohn,Kalamazoo,Mich.，USA)止血并局部按压。用Jeweler’s镊子夹取腓总神经远端，并将之分离至其与胫神经交汇形成坐骨神经处。其间，腓总神经近段的一支关节支必须切断（图13-1)

分离神经外膜、游离腓总神经

坐骨神经的两个分支腓总神经和胫神经可在坐骨切迹以下通过剪开他们的共同神经外膜将它们分离。可用微型剪刀在坐骨神经远端的神经外膜上挑一小口，再沿其长轴纵向切开直至坐骨切迹处。将腓总神经向下向外轻轻牵拉能使分离腓总神经和胫神经更容易。神经外膜一旦被切开，只要用微型剪刀尖端就能钝性将胫神经部分从腓总神经部分分离出。这种神经解剖会使动物感到疼痛，可能需要在此时再加些麻醉剂。然而在这部分解剖中出现一些不随意肌的收缩，属于正常现象。最后在坐骨切迹水平、臀下神经下方将腓总神经切断。

这步解剖在成年大鼠可获得4cm长的周围神经移植物，在成年仓鼠可获得3.5cm长的周围神经移植物。获得的周围神经移植物应立刻被置入生理盐水以备移植之需。只要移植物不干燥，即使在获取和移植周围神经之间有几小时的耽搁，也无碍移植效果。

创口缝合和术后护理

用一根连续的4-0丝质缝合线，将臀肌和胭肌缝合到股四头肌外侧，相当于该肌附着于股骨处用一根连续的2〇或更粗的不可吸收性缝合线（如丝线）或金属夹闭合皮肤，如果选用金属夹，则术后5?7d应予以拆除。皮肤缝合时如果选用2〇以下的细线会因为该鼠或同笼其他鼠咬断缝合线而发生创口过早裂开。然而，一般来说将4?5只鼠放入同一个笼子不会有问题。麻醉过后，尽管术后动物踝关节背屈的能力降低，但是动物还是可以用术侧的腿行走。

获取预先溃变的或新鲜的周围神经移植物

周围神经移植物可在神经解剖后立刻获取（新鲜的周围神经移植物)，或在切断神经近端后留在体内让其经历Wallerian退行性变后再取出（预先溃变的周围神经移植物)。一些研究表明预先溃变的周围神经移植物较之新鲜移植物，在促进轴突生长的速率和fe度方面有轻至中度的提局（ZhaoandKerns1994;Oudegaetal.1994)。这种效应可能是因为轴突切断后诱导雪旺细胞增殖以及营养因子释放增多之故（见前言)。最常见的预先溃变期为7d，但有效的轴突生长可在使用少则3d，多则35d的预先溃变的周围神经移植物上见到（Lewin-Kowaliketal.1992)。也有研究表明预先溃变的周围神经移植物与新鲜移植物相比，并没有増强轴突再生（Ellis，McCaffrey1985),或者再生差别仅出现于早期，随着时间的增加这种差别就不复存在（Lewin-Kowaliketal.

1990)。新鲜的周围神经移植物的确能促进损伤的周围及中枢神经系统的轴突再生，而且不需要外加麻醉剂和手术步骤。

二、周围神经移植物替代视神经

本节介绍的实验步骤源于Vidal-Sanz等（1987)的实验。

眼眶内的视神经切断

1.眼底镜检查视网膜脉管系统：麻醉后、手术前，用眼底镜检查视网膜的血供。

往眼中滴加几滴散瞳剂（1%盐酸环戊酮，Alcon)以扩大瞳孔使易于观察。在手术显微镜下将湿润的塑料玻片或载玻片与角膜接触后，用手术显微镜观察视网膜。

2.头部固定：眼窝的显微手术需要将动物的头部严格固定，但能转动头部从而显露出最大的手术范围.一般标准的定位仪只能固定头部，不能转动头部，故宜选用能夹住动物鼻子周围，使其头部任意转动、颈部能屈伸的头部固定仪（#320和310;DavidKopf,Tujunga，Calif.，USA)。眼窝手术中，可以使用吸力轻柔的抽气泵和湿润的棉花来吸收静脉渗出液，使视野显露清楚。

3.眼窝内显露和视神经横断：从鼻部至枕肌附着部沿中线纵向切开头皮，将手术部位的头皮和骨膜向外侧游离。进入眼眶的途径是在眶上缘切开骨膜并延伸至颞肌的筋膜。用4-0缝合线将骨膜和肌肉向外侧牵拉，此步可能会将一根通过眶上缘下方的一个小孔进入额骨的小静脉血管撕裂。小孔中出血常会自动停止或可以用骨蜡填塞而止住。将泪腺向前游离并覆以湿润的棉花，显露出覆盖于眼球上面的上睑提肌和上直肌。将这些肌肉在附着于眼球5外切断，用一根6-0缝合线穿过这些肌肉并轻轻牵引使眼球向侧、下方转动，显露出眼球后面的视神经。过度牵拉这些肌肉会导致视网膜动脉扭曲和闭塞，引起视网膜缺血或梗死。将视神经外面的硬脑膜在眼球后纵向切开（图13-2,左)，用精细镊子夹住视神经小心地将其从视网膜动、静脉（卧于硬脑膜内壁上、位于视神经的外下方）处移开，在视神经离开眼球处将之横断，注意不要损伤视网膜动、静脉。

动物在其手术侧的晶状体形成白内障并非少见，这些动物不需处死。白内障并不影响视网膜节细胞的存活或轴突再生，只是这种动物在做示踪物的玻璃体内注射时较为困难。

周围神经移植物接至视神经断端

1.将10-0缝合线缝于周围神经移植物：在准备周围神经移植物时，牵引上睑提肌和上直肌的6-0缝合线应予以放松，将10-0缝合线穿过移植用的腓总神经末端的神经外膜。这时最好将全长周围神经移植物置于显露的额骨之上，用湿润的棉花覆之，仅露出末端。周围神经移植物的末端应保留完整的神经外膜，三针单丝10-0缝合线(Ethicon)从夕卜向内穿过神经末端的神经外膜，相互之间距离均等（如位于12点、4点和8点，以末端作为端点)。缝针可用微型持针器或预端呈45°角的钝镊（如SS/45;DumontMedical)夹持^为了尽可能缩短移植中牵引转动眼球的时间，最好在将所有三根缝合线都穿过周围神经移植物后再拉紧6-0缝合线以重新暴露视神经残端。

2.将10-0缝合线缝于视神经残端周围：轻轻牵引6-0缝合线，使眼球侧向转动，重新显露出视神经残端，在视神经的硬膜外鞘演变成眼球巩膜的位置将每根10-0缝合线由里向外穿过巩膜（图13-2,右h缝线应依下列次序放置：在周围神经移植物8点钟位置的缝线（以周围神经移植物断端为轴）应放置于视神经残端边约10点钟的位置;4点钟位置的缝线放置于视神经残端边2点钟的位置；12点钟位置的缝线放置于视神经残端边6点钟的位置，注意，勿将10-0缝合线穿过视神经本身因其没有真正的神经外膜。小心不要损伤硬膜鞘内、视神经下外方的视网膜血管。在打结前所有三根缝合线都应穿过巩膜，否则周围神经移植物会被向下拉到眼球背面并阻碍其他缝合线的放置。器械打结是用缝合线环绕在持针器顶端造个单环，牵线游离端穿过线环后拉紧。每个结至少打成三重，这样，周围神经移植物与视神经就能端-端对合（图13-2)。

3.将周围神经移植物放入颅骨沟内：用电钻（Dremel;Racine，Wis.，USA)在额骨和顶骨钻出一条宽5mm的纵向裂缝，将余下的周围神经移植物置入此缝、放在大脑表面的脑膜之上(图13-3,上)。与周围神经移植物置于头骨之上相比，移植物置于脑膜之上能存活得更好，很可能与增加移植物血供有关。将周围神经移植物的游离端埋植于颈部的肌肉组织并用4-0缝合线缝合打结，以易于以后的识别。将眼球回转至原来的位置，颞筋膜用4-0缝合线闭合，头皮用2-0丝线连续缝合。视网膜再次用眼底镜检查。视网膜动脉狭窄或失去血供，而且在几分钟内不能恢复到正常状态的动物应予以剔除。用抗生素药膏(如polysporin)涂抹两眼防止角膜受损。

三、直接将周围神经移植物植入中枢神经系统

将周围神经移植物植入大脑或脊髓可达下述目的：

一诱导局部的中枢神经系统神经元的轴突长出中枢神经系统、长入移植物
——引导已长入移植物的再生轴突（周围或中枢来源）进一步长入中枢神经系统的特定区域使其重受神经支配弁形成突触联系

上述两者在有关移植物植入方面的技术相似。以下内容仅以周围神经移植物植入脊髓颈段的前角以诱导运动神经元轴突再生为例。附着于眼后的周围神经移植物的游离端常在移植6~10周后被插入上丘（正常情况下接收视网膜节细胞输入的中枢区域)。有关周围神经移植物植入大脑的内容详见Vidal-Sanz等（1987)、Carter等（1989)和Zwimpfer等（1992)的文献。

周围神经移植物植入脊神经根撕裂的动物模型

1.显露脊髓和撕裂脊神经根：如前所述，动物俯卧，其头部用头部固定器固定。沿中线从枕骨至C7棘突处切开皮肤，将颈肌和脊旁肌沿脊柱两侧分离并用缝线牵开。左侧C4和C5椎板以及邻近的关节用尖头咬骨钳去除，打开脊髓左侧的硬脊膜。用尖头的90°角的微型玻璃吸管（见实验准备部分）撕脱左侧C5和C6的前根和后根，要在神经根进入脊髓的部位将其撕脱。之所以要选择C5和C6的神经根作为撕脱的对象，主要考虑到要保留前肢的大部分感觉（由C7,C8,Tl支配）从而降低前肢自残的可能性。

2.周围神经移植物植入脊髓：在将周围神经移植物插入中枢神经系统时，最好将移植物末端分成2~3束，每束插入到不同的部位，这样可以增加周围神经移植物和所在中枢神经系统部位的接触面，比将整段移植物末梢植入一个部位要好。

将周围神经移植物远端的外膜剥离约Icm,显露出的神经末端用2把精细镊子夹住，轻轻地撕成直径近似相等的2~3束（图13-4)。大脑和脊髓的软脑脊膜很有軔性，移植前应预先打开。用皮下注射针（26G或更小）在软脑脊膜上做一缺口以供—束神『插入。该束神经末梢被重新修剪后，用90°角的尖头微型玻璃吸管将其插入脊髓腹外侧Imm深（图13-4)。其他中枢神经系统部位移植物植入深度依照靶神经元的位置而定。神经束或周围神经移植物不H旨受牵拉，可以用明胶海绵（gelfoam)或纤维蛋白胶将之固定。为尽可能地减少将神经束脱出中枢神经系统，靠近中枢神经系统的移植物外膜可用10-0缝线将之固定于周围的脊旁肌上。周围神经移植物的游离末梢用4-0缝合线标记，留在枕骨之上、颈肌下方。

3.准备90°角的微型玻璃吸管以用于脊神经根部撕脱和周围神经移植物插入中枢神经系统：手持玻璃吸管（吸管直径为1.5~2mm)，在煤气火焰上烧并沿吸管长轴方向边烧边拉，使之逐渐细长，当吸管的中心直径变细并尚未冷却时，将吸管两端拉弯与长轴垂直，形成一个短的垂直部和两个90。角的弯曲。待吸管冷却后，将垂直部于中心处(最细的部分）剪断使产生两支前端呈90。角的微型玻璃吸管。这种9〇。角的吸管易于通过手术创口进入中枢神经系统深处，如脊髓的腹外侧。

四、轴突长入周围神经移植物中的中枢神经元的标记

轴突逆行示踪剂的使用（图13-3,图13-4)

1.示踪剂放入周围神经移植物游离末端：在周围神经移植物的游离末端注射本踪剂，可将轴突长入移植物的中枢神经元胞体逆行标记。示踪剂包括辣根过氧化物酶(HRP;Sigma,St.Louis,MO.,USA)和罗丹明-葡聚糖胺（rhodamine-dextranamine,RDA，亦称「FluoroRuby」；Molecularprobes,Cat.#D-1817),它们都可以被损伤的轴突吸收。这些示踪剂或浸透于明胶海绵，或以颗粒状被置于周围神经移植物远端新鲜切开的断面上（图13-3,图13-4)。而突光金（Fluorogold,Fluorochrome,Englewood,Col.，USA),作为一种荧光示踪剂可被损伤的和未损伤的轴突吸收（Koliatsosetal.1994),可直接通过细玻璃管压力注射注入到移植物内。

示踪剂如HRP能以每天50~IOOmm的速度逆向转运（LaVail1975),所以通常在3~5d内足以使神经元被标记。示踪剂被置放的位置应离开移植物进入中枢的部位至少Ion,从而减少因示踪剂弥散而导致的非特异性神经元标记。

2.视网膜全贴片以检查逆行标记的视网膜节细胞（RGC)(图13-3):在使用示踪剂后3~5d处死动物。依次用生理盐水和4%多聚甲醛进行心脏灌注，然后摘除术侧眼球。

注意：不要用戊二醛作为固定液，否则视网膜难以从眼球最外层剥离。切开角膜去除晶状体后，从巩膜-角膜接合处到视杯前面，沿空间半径将眼球四等分，向视杯方向（但不达视杯）切开。将视网膜从眼球上剥离，放入4%多聚甲醛后固定Ih,然后用0?lmol/L磷酸盐缓冲液冲洗数次（有关视网膜制备的更详细步骤参见Stone于1981年编写的「TheWholemountHandbook」)。将视网膜（面向玻璃体的面向上）置于显微镜载玻片上，盖上盖玻片，然后用显微镜观察，使用明视野或荧光主要取决于所使用的示踪剂的类型。如果以HRP作为示踪剂，视网膜应先与相应的底物反应（如四甲基联苯胺，HRP组化反应方法详见Mesulam1982),产生的HRP反应产物可用明视野和电子显微镜观察。

逆行标记的RGC胞体含有一胞核和/或标记的树突，因而易于计数（图13-3)。眶内视神经横断后，成年Sprague-Dawley大鼠视网膜中大约0.5%~3%RGC(大约110000;Perryetal.1983)的轴突能再生、长入周围神经移植物达2.5cm以上（Vidal-Sanzetal.1987)。

3.脊髓的制备以检查轴突再生入周围神经移植物的神经元（图13-4):示踪剂应用后3~5d,依次用生理盐水和4%多聚甲醛对动物进行心脏灌注，完整取出脊髓包括连在脊髓上的周围神经移植物，置于防冷冻的18%蔗糖溶液中过夜，用冷恒温箱切片机切片（横切或纵切)，在荧光显微镜下观察标记的神经元和轴突（图13-4)。

中枢轴突长入周围神经移植物的顺行追踪（图13-5)

示踪剂注射到中枢的细胞核团，可以沿着未损伤的轴突或损伤后再生长入周围神经移植物的轴突（Chengetal.1996)顺行递送。顺行示踪剂包括HRP、植物凝素-白细胞凝集素（phaseolusvulgarisleukoagglutinin,PHA-L;GerfenandSawchenko1984),生物素连接的葡聚糖胺（biotinylateddextranamine,BDA)和一些焚光TK踪剂如RDA和罗丹明-B-异硫氰酸（rhodamine-B^isothiocyanate,RITC;Thanosetal.1987)。

RGC的顺行标记不需要注入大脑，但需要注入眼后房的玻璃体内。HRP因其能被RGC内吞，并顺行标记损伤的或未损伤的轴突而常被用作RGC的顺行示踪剂（图13-5)(Vidal-Sanzetal.1987;CarteretaL1989;Zwimpferetal.1992)。

1.玻璃体内注射轴突示踪剂：左眼滴加几滴散瞳剂（1%盐酸环戊通，Alcon),从而易于在眼底镜检査时清楚地观察到眼内的结构（详见上述)。用26G针在临近巩膜-角膜接合处的巩膜置一小孔，用l〇/JHamilton注射器（#710型；Hamilton,Reno,Nev.，USA)将5jul30%HRP溶液（Boehringer-Mannheim，Ingelheim，Germany)通过此孔注射入玻璃体内。随之将巩膜上的孔用明胶海绵或电灼封闭。动物存活短至2d就能使轴突及其末梢被标记，从而能在光学和电子显微镜下识别。

2.检查HRP标记的、在周围神经移植物以及大脑中再生的RGC的轴突：周围神经移植物以及周围神经移植:物末梢嵌入大脑（即上丘或小脑）的组织学准备详见VidalSanz等（1987)、Carter等（1989)和Zwimpfer等（1992)的文献。再生的RGC轴突及其末梢的HRP反应产物能在光镜（图13-5,上图）和电子显微镜（图13-5,下图）下观察到。