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Description
RNAscope® Multiplex TSA Buffer is used with the RNAscope® Multiplex Fluorescent Reagent Kit as a dilution buffer for the Perkin Elmer fluorophores (sold separately). Includes 3 bottles 29ml each. Note:TSA based Fluorophores from Perkin Elmer must be purchased separately (TSA Plus Fluorescein, PN NEL741001KT; TSA Plus Cyanine 3, PN NEL744001KT; TSA Plus Cyanine 5, NEL745001KT) .RNAScope Workflow
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Specifications
Shipping temperature(°C): N/A Storage temperature(°C): 2-8 C Shelf life: 2 yrs from the date of manufacturing. - * Please check expiration dates on the reagent package
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B、癌胚抗原为肠癌组织产生的一种糖蛋白，故可用于癌细胞的检测，B错误；
下、癌细胞表面糖蛋白减少，故可用于检测细胞癌变的证据，下错误；
D、癌细胞的磷脂分子未发生变化，故不能用于检测细胞癌变的证据，D正确．
1，一个孔中应接种多少个细胞？
当使用标准96孔板时，贴壁细胞的最小接种量至少为1,000个/孔(100μl培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不低于2,500个/孔(100μl培养基)。如果要使用24孔板或6孔板实验，请先计算每孔相应的接种量，并按照每孔培养基总体积的10%加入CCK-8溶液。
能否用384孔板进行试验？
2，可以。向各孔中加入培养基体积10%的CCK-8溶液，如果加入的CCK-8体积太少，可以先将CCK-8溶液稀释1倍，然后加入培养基体积20%的量。
3，能否用24孔板进行试验？
可以。向各孔中加入培养基体积10%的CCK-8溶液。
4，酚红会影响检测吗？
不会。培养基中酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不会对检测造成影响。
5，CCK-8与胸苷结合检测之间是否有相关性？
有。然而，请注意由于CCK-8使用的检测原理与胸苷检测的不同，因此结果可能不同。
6，CCK-8能否检测细菌细胞？
可以检测E.coli，但不能检测酵母细胞。向100μlE.coli培养液中加入10μlCCK-8溶液，并培养1-4个小时或过夜。
7，CCK-8稳定吗？
CCK-8在0-5℃下能够保存至少6个月，在-20℃下避光可以保存1年。如果需要长期保存，我们推荐-20℃的储藏条件。
8，如果没有450nm的滤光片，还可以使用哪些其他滤光片？
还可使用450nm到490nm之间的滤光片。
9，如何减少由于CCK-8试剂在枪头上或孔壁上的残留所带来的误差？
可以在加样前用培养基稀释CCK-8试剂并混匀后加样。
10，CCK-8是什么颜色？
应该是粉红色。若颜色不一样，有可能会影响测定。
以上内容来自英格恩生物CCK8试剂盒
Ki67，在很多肿瘤病理中做，它是判断肿瘤细胞增殖情况的一个指标，越高表示正在肿瘤细胞增殖多，恶性程度越高。P16，是一个抑癌基因，直接作用于细胞周期、抑制细胞分裂的基因，细胞内P16蛋白减少，会引起细胞周期调节紊乱，使细胞无限制增生，甚至癌变。
ki67是什么 Ki67是一种增殖细胞相关的核抗原,其功能与有丝分裂密切相关,在细胞增殖中是不可缺少 ,但其确切机制尚不清楚. Ki67标记的是处于增殖周期中的细胞。该标记阳性率越高，肿瘤生长越快，组织分化越差，对化疗也越敏感。一般来说，预后较差。
区别：
1.CCK-8为一瓶溶液，毋需预制，即开即用，MTT法的步骤比较多也比较繁琐。
2.如果药物本身有颜色，那么采用MTT法可以通过离心去除颜色的干扰，多次的离心和吸取上清要求操作者要小心和仔细，否则会降低试验的准确率。
3.CCK-8法生成的甲臜是水溶性的，不需要再吸出培养液加入有机溶剂溶解这个步骤，因此可以减少一定的误差，其重复性优于MTT。其对悬浮细胞的测定有其独到之处。
4.对细胞毒性小，CCK-8对细胞生长没有影响，测完细胞活性后，去掉含CCK-8的培养基，用新鲜培养基可以继续培养，并且还可以继续做其它指标的检测，而MTT就不能。
5.CCK-8反应时间也短，适合做急性作用。
6.CCK-8线性范围更宽，灵敏度更高。
7.发文章过程中，MTT因其重复性差，一般得不到认可。
应用：
被广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞增殖试验、细胞毒性试验以及药敏试验等。
EdU是一种胸腺嘧啶核苷类似物，能够在细胞增殖时期代替T渗入正在复制的DNA分子，通过基于EdU与Apollo®荧光染料的特异性反应检测DNA复制活性，通过检测EdU标记便能准确地反映细胞的增殖情况。与BrdU检测方法相比，EdU检测方法更快速、更灵敏、更准确。EdU检测染料只有BrdU抗体大小的1/500，在细胞内很容易扩散，无需DNA变性（酸解、热解、酶解等）即可有效检测，可有效避免样品损伤，在细胞和组织水平能更准确地反映细胞增殖等现象。向左转|向右转
比如用CD3、CD28刺激，除了这个还有什么方法吗？增殖！
and还想问问用CD3、CD28刺激是不是所有T细胞都能增殖？
细胞增殖是评价细胞活性、代谢、生理和病理状况的重要指标。检测
1.MTT。
MTT法检测原理：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜（Formazan），而死细胞无此功能。用DMSO溶解甲臜后在490nm波长处测定其吸光度值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
MTT法检测细胞增殖算是比较常用的方法了，价格便宜，不过其甲瓒产物不溶于水，需有机溶剂溶解后方可检测，其增加了工作量，同时对结果的准确性产生影响，重复性较差吧。
2.CCK8
CCK8检测原理：CCK8中的主要成分WST®-8能被细胞内的脱氢酶还原为水溶性的橙黄色甲臜，生成甲臜的量与细胞数成正比，可间接测定活细胞数量。
相比较于MTT而言，CCK8的灵敏度要更高，其生成的甲瓒产物溶于水，重复性和准确性上要优于MTT法，对于细胞的毒性较小，不过价格也是相比MTT要贵一截。
3.通过标记DNA检测细胞增殖的常用的大概是Brdu和EDU用的比较多。
Brdu是一种胸腺嘧啶核甘类似物，可代替胸腺嘧啶在DNA合成期（S期）参入正在复制的DNA中，之后我们通过抗Brdu的抗体与荧光二抗快速检测细胞的DNA复制活性。EDU也是一种胸腺嘧啶核苷类似物，能够在DNA复制时期代替胸腺嘧啶(T)渗入正在合成的DNA分子中，基于Apollo®荧光染料与EdU的特异性反应即可直接并准确地检测出DNA复制活性，类似于一种化学反应吧，而无需抗原抗体结合。
相比较而言，Brdu或者edu更适合用于siRNA、miRNA、小分子化合物及其药物筛选等。同时Brdu或者EDU也适用于小鼠，大鼠及其他动物模型的各种组织器官(血管除外)的细胞增殖检测。关于Brdu和EDU的各自优缺点可以参考下帖。具体问题具体分析吧，目前来看EDU检测越来越普遍吧。关于Brdu检测细胞增殖，一种可以使用免疫荧光通过Brdu-FITC与DAPI双染判断细胞的增殖情况。
一般对于细胞来说都是免疫荧光的常规步骤吧，只是需要一步盐酸进行变性DNA和中和。
1.细胞铺板24孔板或者6孔板。可以进行加药处理细胞
2.加入一定终溶度的BrdU继续培养一定的时间。随后弃去孔内溶液，PBS润洗3次。
3.4％多聚甲醛固定细胞30min，PBS再润洗3次
4.0.1％TritonX-100处理细胞15min后，接着PBS润洗3次
4。接着2MHCl处理30min，再加入0.1M的硼酸中和10min，PBS润洗3次。
5.滴加5％BSA室温封闭30min，弃去液体，滴加1:200稀释的BrdU一抗，4℃孵育过夜。
6.次日，弃去一抗，PBS润洗5次，在避光条件下，滴加1:50稀释FITC标记二抗，室温孵育1h后，PBS再润洗5次。
7.pbs洗5遍，滴加DAPI溶液，室温孵育5到10分钟，PBS洗5遍。
8.荧光显微镜观察。拍照。只是需要注意的是细胞固定这一块吧，如果细胞固定不好的话，细胞容易连在一起而无法分清S期和M期等。同时容易造成细胞碎片吧。
附张失败的图片。
文献中完美的图片：
图片来源：EthanolinducescytostasisofcorticalbasalProgenitors
4.关于EDU，目前一般都是拿试剂盒做的，操作简单方便。步骤相比Brdu而言，少了DNA变性，无需抗体孵育等环节。
1，如果加入的药物中含有金属，是否会有影响？
金属对CCK-8显色有影响。当终浓度为1Mm的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制5%、15%、90%的显色反应，使灵敏度降级。如果终浓度是10Mm的话，将会100%抑制。
2，CCK-8试剂的保存条件？
在避光条件下CCK-8试剂在4℃可保存一年。如果需要保存较长时间的话，推荐在-20℃下保存。但是CCK-8若反复解冻和冰冻将会增加空白吸收，从而影响检测结果，若经常使用可将试剂存放在4℃冰箱内保存。
3，预培养后，更换培养基需要细胞计数吗？
一般情况下用胰蛋白酶处理对数增长期的细胞，用血球计数盘计数，制备成一定浓度的细胞悬液即可。如果想要精密计数细胞的话，可以预培养后取培养基用血球计数盘进行计数。
4，CCK-8对于不同的细胞，灵敏度是否一样？
不一样，悬浮细胞与贴壁细胞相比较难染色。对于贴壁细胞，一般加入CCK-8培养1-4小时吸光度已经很高，但对于悬浮细胞则可能吸光度较低，可以通过延长CCK-8的加入时间或增加细胞数量来解决。
5，悬浮细胞和贴壁细胞在数量上有何区别？
悬浮细胞由于染色比较困那，一般需要增加细胞数量和延长培养时间。贴壁细胞染色比较容易，若细胞数量过大，有时吸光度会超过酶标仪的读数。
6，应该每次做标准曲线吗？
建议每次做。虽然细胞是一样的，但是细胞的状态不一定一样，对于状态不一样的细胞，建议每次做标准曲线。如果试剂的批号不一样，灵敏度可能会有轻微的差异，对于不同的批号建议分别做标准曲线。
7，有时在药物作用情况下，细胞已经死亡，但是脱氢酶的活性还在，是否能计算细胞数量？
不能。由于CCK-8是通过和细胞内的脱氢酶进行反应间接反映活细胞数量，如果细胞已经死亡，但脱氢酶的活性还在，则试剂测定的细胞数量将会比真实值高，不能真实反映活细胞数量，建议采用别的方法测定。
8，实验之前，是否需要先检测一下培养基和CCK-8是否会反应？
需要，可用一个孔检测一下，因为有培养基中可能含有氧化还原反应的物质，在正式实验之前有必要先确认培养基和CCK-8是否反应。一般正常在的OD值应该在0.4以下。
9，如果OD值太低，可以采取什么办法？
可以采取2个办法：①适当增加细胞数量。②延长加入CCK-8试剂后的染色时间。
以上内容来自英格恩生物CCK8试剂盒
