MatTek’spatentedEpiDermsystemisaleADInginvitrotestingtechnologyfordermaltoxicologistsandformulationscientists.WithmultipleECVAMvalidationsandOECDacceptedtestguidelines,EpiDermisaproveninvitromodelsystemforchemical,pharmaceuticalandskincareproducttesting.
- SkinIrritation(OECDTG439)andCorrosion(OECDTG431)Testing
- ProducedunderGMP
- Excellentinvitro–invivocorrelation
Technology:
AlsoknowngenericallyasaReconstructedHumanEpidermis(RHE),EpiDermisaready-to-use,highlydifferentiated3Dtissuemodelconsistingofnormal,human-derivedepidermalkeratinocytes(NHEK)culturedonspeciallypreparedtissuecultureinserts.
Culturedattheair-liquidinterface(ALI),EpiDermallowsfortheevaluationoftopicallyappliedcompounds,chemicals,cosmetic/personalcareproductingredientsandfinalformulations.Withourstraightforwardprotocolsand20+yearsofdata,EpiDermisthegoldstandardforabroadrangeofhighlypredictiveinvitroapplications.
EpiDermexhibitshumanepidermaltissuestructureandcellularmorphologywithgreateruniformityandreproducibility.It’s3Dstructureconsistingoforganizedandproliferativebasalcells,spinousandgranularlayers,andcornifiedepidermallayersaremitoticallyandmetabolicallyactive.
Applications:
TheEpiDerm3Dhumantissuemodelisusedacrossadiverserangeofapplicationsincludingsafetyandriskassessment,andBIOLOGicalefficacy.WithAir-liquidInterface(ALI)culturetechnology,EpiDermcanbeusedtoevaluatebiologicalresponsestotopicalapplicationsofformulationsoringredients.Simpleprotocolsandtheevaluationofearlycellularendpointsallowresearchtoacquiredataindays,notweeksormonths.
SkinIrritation(OECDTG439)
UseEpiDermtodeterminetheskinirritationpotentialofliquids,solids,gels,lotions,ointmentsorcreams.TissueviABIlityresultsareacquiredwithin3days.
SkinIrritationTestProtocol
SkinCorrosion(OECDTG431)
Determinetheskincorrosionpotentialoftestmaterialsinasingleday.
SkinCorrosionProtocol
SkinHydration
MeasuretheelectricalimpedanceofEpiDermtoassesstheefficacyoftopicallyappliedmoisturizersincludingcreams,gelsandlotions.TheSkinHydrationprotocolallowsfordataanalysiswithin24hours.
SkinHydrationApplicationNote
DermalDrugDelivery
UtilizeexistingtransdermalpermeationequipmentorMatTek’ssimplesingleinsertpermeationdevicestoassessAPIpermeationandflux.DeterminerelativesafetywiththeEpiDermMTTET-50assay.
PercutaneousAbsorptionProtocol
Phototoxicity
IdentifyphototoxiceffectsoftopicalorsystemictestsubstancesusingtheEpiDermPhototoxicityAssay(pre-validated)
PhototoxicityProtocol
DermalGenotoxicity
IdentifygenotoxiceffectsoftopicalorsystemictestsubstancesusingEpiDermGenotoxicityAssays(pre-validated)
MicronucleusAssayProtocol
CometAssayProtocol
EpidermalDifferentiation
Evaluateactivecompoundsforeffectsonepidermaldifferentiationusingtheunder-developedEpiDermtissuemodel
BrowseourreferencelibrarytoseehowourEpiDermtissuehasbeenusedintheseareasofstudy.
TechSpecs:
Tissue
Kit:AstandardEpiDermkit(EPI-200)consistsof24tissues.(Tissue“kits”containtissues,asmallamountofculturemedium,andplasticware;contactMatTekforspecifickitcontents)
Formats:9mm&22mmindividualinsertsand96-wellHTSplates–tissueculturesubstrateischemicallymodifieswithaporesizeof0.4μm
Culture:Air-liquidinterface
Histology:8-12celllayersplusstratumcorneum(basal,spinous,andgranularlayers)
Lotnumbers:Tissuelotsproducedeachweekareassignedaspecificlotnumber.Aletterofthealphabetisappendedtotheendofthelotnumbertodifferentiatebetweenindividualkitswithinagivenlotoftissues.Alltissuekitswithinalotareidenticalinregardstocells,medium,handling,cultureconditions,etc.
Shipment:At4°Conmedium-supplemented,agarosegels
Shipmentday:EveryMonday.ShipmentonThursdayalsopossIBLeuponspecialrequest
Delivery:TuesdaymorningviaFedExpriorityservice(US).OutsideUS:Tuesday-Thursdaydependingonlocation
Shelflife:Includingtimeintransit,tissuesmaybestoredat4°Cforupto6dayspriortouse.However,extendedstorageperiodsarenotrecommendedunlessnecessary.Inaddition,thebestreproducibilitywillbeobtainediftissuesareusedconsistentlyonthesameday,e.g.Tuesdayafternoonorfollowingovernightstorageat4°C(Wednesdaymorning)
Lengthofexperiments:Culturescanbecontinuedforupto3weekswithgoodretentionofnormalepidermalmorphology.Culturesmustbefedeveryotherdaywith5.0mloflonglifemaintenancemedium(EPI-100-LLMM),standardmaintenancemedium(EPI-100-MM),ornewmaintenancemedium(EPI-100-NMM).Extendedcultureexperimentsrequiretheuseofculturestands(MEL-STND;seephoto)orwashers(EPI-WSHR)in6-wellplatestoallowforculturingin5.0mlofculturemedium
Cells
Type:Normalhumanepidermalkeratinocytes(NHEK)
Geneticmake-up:Singledonor
Derivedfrom:Neonatal-foreskintissue(NHEK)
Alternatives:NHEKfromadultbreastskin
Screenedfor:HIV,Hepatitis-B,Hepatitis-C,mycoplasma
Medium
Basemedium:Dulbecco’sModifiedEagle’sMedium(DMEM)
Growthfactors/hormones:Epidermalgrowthfactor,insulin,hydrocortisoneandotherproprietarystimulatorsofepidermaldifferentiation
Serum:None
Antibiotics:Gentamicin5µg/ml(10%ofnormalgentamicinlevel)
Anti-fungalagent:AmphotericinB0.25µg/ml
pHIndicator:Phenolred
Otheradditives:Lipidprecursorsusedtoenhanceepidermalbarrierformation(proprietary)
Alternatives:Phenolred-free(EPI-200-PRF),antibiotic-free(EPI-200-ABF),anti-fungal-free(EPI-200-AFF),orhydrocortisone-freemediumandtissue(EPI-200-HCF)areavailable.Agentsareremovedatleast3dayspriortoshipment.PleasediscussyourspecificmediaformulationandtissueneedswithMatTekscientificpersonnelbeforeplacingyourorder.
Assay/Maintenancemedium:Threemaintenancemediaareavailable.EPI-100-MMisequivalenttotheassaymediumusedforshorttermtoxicologicaltesting.LongLifeMaintenanceMedium,EPI-100-LLMM,containsα-MSHandβ-FGF.NewMaintenanceMedium,EPI-100-NMM,containsKeratinocyteGrowthFactor(KGF),butdoesnotcontainα-MSHandβ-FGF.Althoughallmediawillresultingoodretentionofepidermalmorphologyforupto3weeks(5.0mlchangedeveryotherday),useofEPI-100-NMMwillgivetheoptimalhistologyforlongtermstudies.
QualityControlandSterility
Visualinspection:Alltissuesarevisuallyinspectedandifphysicalimperfectionsarenoted,tissuesarerejectedforshipment
End-usetesting:Tissuesareexposedto1%TritonX-100for4,6,8and12.5hours.Thetimeofexposurerequiredtoreducethetissueviability(ET-50)usingtheMTTviabilityassayisdetermined(SeeMatTekEpiDermMTTET-50Protocol)foreachlotoftissue.ET-50’smustfallwithintherangeofthe1996EpiDermdatabaseof4.77–8.72hours.ET-50’sincustomers’labsmaydifferslightlyfromtheMatTekresults.
Sterility:Allmediausedthroughouttheproductionprocessischeckedforsterility.Maintenancemediumisincubatedwithandwithoutantibioticsfor1weekandcheckedforsterility.Theagarosegelfromthe24-wellplateusedforshippingisalsoincubatedfor1weekandcheckedforanysignofcontamination
Screeningforpathogens:AllcellsarescreenedandarenegativeforHIV,hepatitisBandhepatitisCusingPCR.However,noknowntestmethodcanoffercompleteassurancethatthecellsarepathogenfree.Thus,theseproductsandallhumanderivedproductsshouldbehandledatBSL-2levels(biosafetylevel2)orhigherasrecommendedintheCDC-NIHmanual,“Biosafetyinmicrobiologicalandbiomedicallaboratories,”1998.Forfurtherassistance,pleasecontactyoursiteSafetyOfficerorMatTektechnicalservice
Notificationoflotfailure:IfatissuelotfailsourQCorsterilitytesting,thecustomerwillbenotifiedandthetissueswillbereplacedwithoutchargewhenappropriate.BecauseourQCandsterilitytestingisdonepost-shipment,notificationwillbemadeassoonaspossible(Undernormalcircumstances,ET-50failureswillbenotifiedbyWednesday5p.m.;sterilityfailureswillbenotifiedwithin8daysofshipment)
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自噬是一个吞噬自身细胞质蛋白或细胞器并使其包被进入囊泡，并与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物的过程，藉此实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新。
1，CCK-8能否对活细胞进行染色？
不能。因为CCK-8的主要成分是一种水溶性的四唑盐(WST-8)，并通过电子载体PMS将活细胞中的电子交换到培养基中的WST8上。由于生成的甲臜也是高度水溶性的，因此CCK-8不能对细胞进行染色。
2，CCK-8检测溶液对细胞是否有毒？
CCK-8溶液自身因为高浓度的PMS的存在而具有一点毒性。但是，加到培养基中的CCK-8是没有毒性的，因为被稀释了10倍。因此，长时间的培养，如过夜或者培养数天是可以的。同一个细胞培养液在CCK-8检测后还可以用于其他细胞增殖检测，如结晶紫检测，中性红检测或者DNA荧光检测等。由于每种细胞对于CCK-8的耐受力都不同，因此在需要进行长时间培养时，先检测一下细胞在加入CCK-8培养后的活力。
3，在做加药实验时，药物对测定是否有影响？如何解决？
有时会有影响。如果药物具有还原性，会和CCK8发生显色反应，增加吸光度。解决办法：首先要确认药物是否有吸收，在含有药物的培养基中加入CCK-8，测定450nm的吸光度，如果它的吸光度比不含药物的培养基(加CCK-8)的吸光度高，则证明药物有影响，可在加CCK-8之前更换培养基，去掉药物的影响。
4，每次测定的数值不一样，是什么原因？如何解决？
可能会有以下几个原因：1.当在培养箱内培养时，培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发，由于体积不准确而增加误差。一般情况下，最外一圈的孔只加培养基，不作为测定孔用。2.有可能会因为CCK-8沾在壁上而产生误差，建议在加入CCK-8后，轻轻敲击培养板以帮助混匀。3.每孔的细胞数量过多或过少。请预先在1,000-100,000个/孔范围内摸索条件。
5，如何设定空白对照？
在不含细胞的培养基中加入CCK-8，培养一定的时间，测定450nm的吸光度即为空白对照。在做加药实验(细胞毒性实验)时，还应考虑药物的吸收，可在不含细胞，加入药物的培养基中加入CCK-8，培养一定的时间，测定450nm的吸光度作为空白对照。
6，哪些物质会影响CCK8的测定？
当有还原性物质存在时会影响CCK-8的测定，例如含有维生素C的Glucose等(一般培养基中的量不多，酚红或血清不影响测定)。在有酚红存在的情况下，会增加空白吸收，但不影响测定，扣除空白吸收即可。
7，在实验中吸光度值太高，如果不能减少细胞数量，如何解决？
可以缩短加入CCK-8后的培养时间。例如：可以把加入CCK-8试剂后的培养时间由2小时缩短为1小时。
8，设定参比波长的目的是什么？必须设定吗？
不一定要设定。CCK-8试剂在参比波长没有吸光度。设定参比波长的目的是为了取出由于样品混浊所带来的吸收。
9，说明书上仅写了96孔板的测定方法，如果使用24孔板或12孔板，应该加多少量CCK-8试剂？
一般情况下建议加入CCK-8试剂的量是培养基体积的1/10。
10，在CCK-8显色过程中，如何终止反应？
有一下几种方法（96孔板）：①在显色反应后，将培养板放置4℃冰箱内。②每孔加10μl0.1MHCL溶液。③每孔加10μl的1%（w/v）的SDS（十二烷基硫酸钠）溶液。注意：反应停止后，应在24小时之内测定。
11，必须预培养细胞吗？
不一定。如果要向保持细胞的最好状态，建议预培养细胞。如果不做细胞预培养，细胞内的脱氢酶可能会不稳定。也有人不做细胞预培养，但在做标准曲线和检测时需要统一检测条件。
以上内容来自英格恩生物CCK8试剂盒
刚入实验坑的新人一枚，有关凋亡和增殖的检测方法看来看去有好多啊，我想问下大神们目前用的最多的有关细胞凋亡和增殖的检测方法分别是什么？哪些相对更加精确一些，而哪些只是粗略的看一下啊？？
我做的课题与移植免疫耐受有关，目前在做的就是体外MLR。实验protocol如下：
供体小鼠（Balb/c）脾淋巴细胞经磁珠分选提取APC细胞，辐照灭活后作为刺激细胞。受体小鼠（C57）脾淋巴细胞经磁珠分选提取cd3细胞用CFSE标记作为反应细胞。调整供体细胞密度为5×10^6/ml，受体细胞密度为1×10^6/ml，分别按2:1，5:1，10:1的比例加入圆底96孔板，每组3个复孔，同时设单纯受体细胞和受体自身APC－cd3混合培养作为阴性对照组，37℃5%CO2共培养3天。共培养3天后收集细胞，3个复孔合并成一管，经PBS洗涤，加入CD3-PE流式抗体孵育标记T细胞，上流式细胞仪检测受体T细胞增殖程度。
结果：流式检测结果如下图所示，图3是各浓度梯度组间比较，想请教图中左侧是否为正常的增殖峰，因为此前多次结果均显示为宽大的单峰，未观察到所谓的细胞增殖峰，查阅之前的研究结果多数显示如未加细胞刺激物，单凭细胞的刺激作用形成的增殖相当微弱，极少呈现这样单个高尖的增殖峰。
图1
图2
图3（从上往下（黄、红、蓝）分别为5:1，2:1，10:1混合培养组）
单纯受体细胞的空白组没有增殖这个没有问题，但奇怪的是图4里作为阴性对照的反应组也是同样的双峰结果，尽管刺激效果不如前三组明显，但理论上用自身的APC刺激自身的cd3根本不会出现增殖，不知这样的结果是属于正常增殖还是假阳性结果，因为我们的阴性对照组细胞在镜下看被污染了，是否会受此影响表现为细胞增殖？
因本人刚接触免疫细胞实验不久，可能描述的问题比较小白，如有不当请大神们指正，非常感谢^^
图4（从下往下（黄、蓝、红）分别为空白组、5:1混合培养组和自身对照组）
减数分裂也是真核生物细胞增殖的方式之一。
真核生物细胞增殖的方式有：有丝分裂、无丝分裂和减数分裂。
1，一个孔中应接种多少个细胞？
当使用标准96孔板时，贴壁细胞的最小接种量至少为1,000个/孔(100μl培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不低于2,500个/孔(100μl培养基)。如果要使用24孔板或6孔板实验，请先计算每孔相应的接种量，并按照每孔培养基总体积的10%加入CCK-8溶液。
能否用384孔板进行试验？
2，可以。向各孔中加入培养基体积10%的CCK-8溶液，如果加入的CCK-8体积太少，可以先将CCK-8溶液稀释1倍，然后加入培养基体积20%的量。
3，能否用24孔板进行试验？
可以。向各孔中加入培养基体积10%的CCK-8溶液。
4，酚红会影响检测吗？
不会。培养基中酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不会对检测造成影响。
5，CCK-8与胸苷结合检测之间是否有相关性？
有。然而，请注意由于CCK-8使用的检测原理与胸苷检测的不同，因此结果可能不同。
6，CCK-8能否检测细菌细胞？
可以检测E.coli，但不能检测酵母细胞。向100μlE.coli培养液中加入10μlCCK-8溶液，并培养1-4个小时或过夜。
7，CCK-8稳定吗？
CCK-8在0-5℃下能够保存至少6个月，在-20℃下避光可以保存1年。如果需要长期保存，我们推荐-20℃的储藏条件。
8，如果没有450nm的滤光片，还可以使用哪些其他滤光片？
还可使用450nm到490nm之间的滤光片。
9，如何减少由于CCK-8试剂在枪头上或孔壁上的残留所带来的误差？
可以在加样前用培养基稀释CCK-8试剂并混匀后加样。
10，CCK-8是什么颜色？
应该是粉红色。若颜色不一样，有可能会影响测定。
以上内容来自英格恩生物CCK8试剂盒
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