混合淋巴细胞培养（MLR）的细胞增殖问题
2018-01-22
问题描述：
我做的课题与移植免疫耐受有关，目前在做的就是体外MLR。实验protocol如下：
供体小鼠（Balb/c）脾淋巴细胞经磁珠分选提取APC细胞，辐照灭活后作为刺激细胞。受体小鼠（C57）脾淋巴细胞经磁珠分选提取cd3细胞用CFSE标记作为反应细胞。调整供体细胞密度为5×10^6/ml，受体细胞密度为1×10^6/ml，分别按2:1，5:1，10:1的比例加入圆底96孔板，每组3个复孔，同时设单纯受体细胞和受体自身APC－cd3混合培养作为阴性对照组，37℃5%CO2共培养3天。共培养3天后收集细胞，3个复孔合并成一管，经PBS洗涤，加入CD3-PE流式抗体孵育标记T细胞，上流式细胞仪检测受体T细胞增殖程度。
结果：流式检测结果如下图所示，图3是各浓度梯度组间比较，想请教图中左侧是否为正常的增殖峰，因为此前多次结果均显示为宽大的单峰，未观察到所谓的细胞增殖峰，查阅之前的研究结果多数显示如未加细胞刺激物，单凭细胞的刺激作用形成的增殖相当微弱，极少呈现这样单个高尖的增殖峰。
图1
图2
图3（从上往下（黄、红、蓝）分别为5:1，2:1，10:1混合培养组）
单纯受体细胞的空白组没有增殖这个没有问题，但奇怪的是图4里作为阴性对照的反应组也是同样的双峰结果，尽管刺激效果不如前三组明显，但理论上用自身的APC刺激自身的cd3根本不会出现增殖，不知这样的结果是属于正常增殖还是假阳性结果，因为我们的阴性对照组细胞在镜下看被污染了，是否会受此影响表现为细胞增殖？
因本人刚接触免疫细胞实验不久，可能描述的问题比较小白，如有不当请大神们指正，非常感谢^^
图4（从下往下（黄、蓝、红）分别为空白组、5:1混合培养组和自身对照组）
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jinglebellchang
用户
这是培养3天后的镜下情况，因为是用手机拍的不太清楚，如果无法判断的话请大神们无视（以上分别为2:1，5:1，10:1混合培养组）
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zlq0213
用户大家一起谈论一下，我不是很懂，也是新手
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花花zmm
用户我目前也在做MLR,只是我的细胞来源是人的PBMC，从你第二张图来看，CFSE阳性的细胞群是有的，CFSE阴性或者弱阳性的群也是有的，但是第三幅图CFSE+的峰不明显，CFSE-的峰很明显，感觉这有点奇怪，而且我们做的流式图，增殖也很明显，CFSE-和CFSE+的峰都很明显，应该是增殖了，但是你阴性对照也增殖，我没做过，所以不好说，建议你染个7AAD，区分下死活细胞，然后重复实验看看
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jinglebellchang
用户展开引用花花zmm我目前也在做MLR,只是我的细胞来源是人的PBMC，从你第二张图来看，CFSE阳性的细胞群是有的，CFSE阴性或者弱阳性的群也是有的，但是第三幅图CFSE+的峰不明显，CFSE-的峰很明显，感觉这有点奇怪，而且我们做的流式图，增殖也很明显，CFSE-和CFSE+的峰都很明显，应该是增殖了，但是你阴性对照也增殖，我没做过，所以不好说，建议你染个7AAD，区分下死活细胞，然后重复实验看看......非常感谢你的回复和建议，我们也想染7AAD验证下细胞活性，另外想请问下你们mlr是否不加细胞刺激因子也可以获得明显的增殖结果？
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花花zmm
用户是，我们都没有加任何细胞因子，只是用的15%的FBS+1640培养，增殖很明显
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