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品牌 / 
metkinen
货号 / 
203-50
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首先说明,因为最近有人向我要,我以前也发过,好像是试剂配方不全,所以在此补发一个,望版主不要删了!多谢!

快速细胞破碎法鉴定转化子DNA(分离效果一般,二者要相差比较大才行,我常用前者,一般T载体上的要五百bp以上,一千bp以上最好!)
快速细胞破碎法鉴定转化子DNA

1、转化子菌落接种于相应的抗性培养基2.0ml,过夜培养。(要求设立对照!)
2、制备0.8%琼脂糖胶。
3、取1.5ml过夜培养物离心,15kr/min,1min;弃上清。(剩余保种!)
4、加水重悬,离心如上。留沉淀。
5、每管加50—100µl破碎细胞缓冲液(见后配方),充分涡旋,使菌体悬浮均匀
6、水浴37℃,15min。
7、离心15kr/min,15min。
8、立即取20-30µl上清点样进行电泳,4—6V/cm。
9、电泳,当溴酚蓝到达凝胶板的2/3时,停止电泳。
10、染胶15—30min。
配方:50mMTris-HCl(pH6.8);1%SDS;2mMEDTA;400mM蔗糖;0.01%溴酚兰
配法:1MTris-HCl(pH6.8),10ml;20%SDS,10ml;250mMEDTA,1.6ml;蔗糖27.2g;1.2%溴酚兰1.67ml加水至200ml;

煮沸法快速分析转化子DNA

1、挑单菌落于2.0ml相应抗生素液体培养基中,37℃振荡过夜(约16小时)。
2、取1.5ml过夜培养物于离心管中,15kr/min,1min。(剩余保种!)
3、弃上清,倒扣、流尽。
4、加入350µl由下列试剂组成溶液,混匀。
(8%蔗糖、0.5%TritonX-100、50mMEDTA(pH8.0)、10mMTris-HCl(pH8.0))
5、加入25µl新鲜配制的10mg/ml的溶菌酶(溶于10mMTris-HClpH8.0中),涡旋3--5sec。
6、立即将离心管浸入沸水浴40sec。
7、离心15kr/min,10min。
8、转移上清至另一离心管,加入2.5MNaAc40µl,加入异丙醇420µl,混匀后冰浴15min,沉淀DNA。
9、离心15kr/min,15min,将上层异丙醇弃去,真空抽干。
10、加入50µlTE缓冲液重悬,(含Rnase50µg/ml)。37℃保温10min。
11、取10µl样品点样,电泳,染胶。观察质粒DNA的区带位置。(要求有对照电泳!)
用5毫升规模的菌表达蛋白,收菌用缓冲液重悬后有250微升的重悬液,通常是加LoADIngBuffer混匀后煮样破碎细胞,但现在我还需要对细胞中的蛋白进行进一步处理,但如此少的重悬液又无法用超声波破碎,而煮样后所有蛋白都变性了,又无法继续处理,谁能告诉我还有什么效果好的破碎这样的重悬液的方法?
加loADIngbuffer裂解细胞/细菌以后,样品里面的DNA会和SDS形成一团东西,无法直接上样

平常都是用超声破清洗器水浴超声破碎大约20分钟,然后上样的

但是一方面,常温超声不知道会不会造成蛋白降解破坏,因为发现加冰以后超声会变得非常弱,所以都么加冰。另一方面,因为水浴超声声强是不均匀的,如果样品多的话,会发现有些已经超碎DNA,但有些还是一团。

不知道是否有其他更好的方法?
最近在用水稀释法加硫酸铵做卵黄抗体的初步纯化,在水稀释这步担心由于颗粒物质没有和水溶液充分混合,导致卵黄抗体回收率降低,于是将第一次水稀释后得到的上清进行离心后,又将沉淀用水重悬混合,用相同的方法再来考察是否有残留的卵黄抗体,从SDS-PAGE中可以发现,沉淀中是有残留的,而且量还不算少,于是我考虑在卵黄加入水稀释后,用超声波来混匀,使卵黄里面的颗粒物质更均匀更充分的释放在水溶液里,我的问题是应该采取怎么样的一个程序呢,即不影响我的蛋白活性也能更好的提高回收率?

大家请赐教!
我想用大肠杆菌来表达一种磷脂酶,目前我用的方法是先加溶菌酶和保护剂,15-20min后,再用超声波1min,可是跑出的带很不清晰,看上去就是一片蓝而已,好像是有所降解吧。不知是哪里做的不好了
样品一般都要做到最好,你看成品的具体要求,水分、细度、合格率等。
RKEF工艺技术123
2017-09-30
什么是RKEF工艺
想问一下,一般破碎细胞冻融时间要多久,几次。冻融时间与次数与细胞破碎程度有关吗?因为我们这一般都是十二小时一次,共三次。但因为我必须一天完成,所以我第一次三小时,化一小时,第二次二小时,化半小时,第三次冻只有一小时。我不知这样破碎是否完全。
另外还想问一下,还有其他可行的破碎方法吗
谢谢
超声波细胞破碎123
ecor2004-10-19
我最近做超声波破碎大肠杆菌,但是一直效果都不好,看了一些帖子,但是还是没弄明白。请问:裂解缓冲液需要加多少(?ml/g菌)?超声波作用的时间一般是多少(有人说半小时,有人说10分钟以内)?破碎后菌液是什么状态的?会变澄清吗?如果一次做60ml菌液(置于100ml离心管中),需要注意什么呢?
我打算做蛋白提取,以前单纯用超声效果不好,为了尽量保留活性,选择用溶菌酶见超声破碎的方法。
我按照分子克隆上的步骤:
1.菌体称重为0.4g,加PBSbuffer3ml(PH=8.05),充分混匀。
2.加现配的50mg/ml溶菌酶溶液240微升,至终浓度4mg/ml。冰置3小时。
3.超声400w,10s,10s,40次,结果目测还是乳白色,镜检很多菌体。

为什么破不开,搞不懂,我前几天做预实验的时候,还能变澄清???
注:预实验的步骤与现在的一样,只是菌体重量是0.1g加PBS3ml,再加溶菌酶至1mg/ml,超声400w,10s,10s,20次。

麻烦大家能给以帮助,先谢谢了...
大家好,有谁知道真菌细胞壁的破碎方法,各种试剂的使用浓度,越详细越好,谢谢
酵母细胞的破碎实验123
liuyujia2007-04-05
欲破碎酵母细胞,提取胞内活性物质。尝试了超声波处理、热水处理、石英砂研磨、SDS、DMSO、甲苯处理、反复冻溶等方法,镜检观察效果都很不理想。请问还有什么方法较有效,或者是否有更可靠的检测方法?谢谢!