染色质免疫共沉淀可以:
(1)组蛋白修饰酶的抗体作为「生物标记」;
(2)转录调控分析;
(3)药物开发研究;
(4)DNA损失与凋亡分析。
实验步骤:
一、细胞的甲醛交联与超声破碎(第一天)
1. 取出1平皿细胞(10cm平皿),加入243ul37%甲醛,使得甲醛的终浓度为1%(培养基共有9ml)。
2. 37℃孵育10min.
3. 终止交联:加甘氨酸至终浓度为0.125M。450ul2.5M甘氨酸于平皿中。混匀后,在室温下放置5min即可。
4. 吸尽培养基,用冰冷的PBS清洗细胞2次。
5. 细胞刮刀收集细胞于15ml离心管中(PBS依次为5ml,3ml和3ml)。预冷后2000rpm5min收集细胞。
6. 倒去上清。按照细胞量,加入SDSLysisBuffer。使得细胞终浓度为每200ul含2×106个细胞。这样每100ul溶液含1×106个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。假设MCF7长满板为5×106个细胞。本次细胞长得约为80%。即为4×106个细胞。因此每管加入400ulSDSLysisBuffer。将2管混在一起,共800ul。
7. 超声破碎:VCX750,25%功率,4.5s冲击,9s间隙。共14次。
二、除杂及抗体哺育(第一天)
1. 超声破碎结束后,10000g4℃离心10min。去除不溶物质。
2. 留取300ul做实验,其余保存于-80℃。
3. 300ul中,100ul加抗体做为实验组;100ul不加抗体做为对照组;100ul加入4ul5MNaCl(NaCl终浓度为0.2M),65℃处理3h解交联,跑电泳,检测超声破碎的效果。
4. 在100ul的超声破碎产物中,加入900ulChIPDilutionBuffer和20ul的50×PIC。
再各加入60ulProteinAAgarose/SalmonSpermDNA。4℃颠转混匀1h。
5. 1h后,在4℃静置10min沉淀,700rpm离心1min。
6. 取上清。各留取20ul做为input。一管中加入1ul抗体,另一管中则不加抗体。4℃颠转过夜。
三、检验超声破碎的效果(第一天)
1. 取100ul超声破碎后产物,加入4ul5MNaCl,65℃处理2h解交联。
2. 分出一半用酚/氯仿抽提。电泳检测超声效果。
四、免疫复合物的沉淀及清洗(第二天)
1. 孵育过夜后,每管中加入60ulProteinA Agarose/SalmonSpermDNA.4℃颠转2h。
2. 4℃静置10min后,700rpm离心1min。除去上清。
3. 依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗的步骤:加入溶液,在4℃颠转10min,4℃静置10min沉淀,700rpm离心1min,除去上清。
洗涤溶液:
(1)lowsaltwashbuffer-onewash
(2)highsaltwashbuffer-onewash
(3)LiClwashbuffer-onewash
(4)TEbuffer-twowash
4. 清洗完毕后,开始洗脱。
洗脱液的配方:100ul10%SDS,100ul1MNaHCO3,800ulddH2O,共1ml。
每管加入250ul洗脱buffer,室温下颠转15min,静置离心后,收集上清。重复洗涤一次。最终的洗脱液为每管500ul.
5. 解交联:每管中加入20ul5MNaCl(NaCl终浓度为0.2M)。
6. 混匀,65℃解交联过夜。
五、DNA样品的回收(第三天)
1. 解交联结束后,每管加入1ulRNaseA(MBI),37℃孵育1h。
2. 每管加入10ul0.5MEDTA,20ul1MTris.HCl(PH6.5),2ul10mg/ml蛋白酶K.45℃处理2h。
3. DNA片段的回收----omega胶回收试剂盒。最终的样品溶于100ulddH2O。
六、PCR分析(第三天)
更多详情请点击》》