[求助]带histag标签的包含体纯化、浓缩及制备抗体的问题

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2006-01-22

问题描述：

请问：我用pet-32表达了我的目标蛋白，想用做抗原制备多克隆抗体。目标蛋白是以包含体的形式表达的融合蛋白，我用8M的尿素进行溶解后上Ni柱进行纯化，但整个过程中遇到了很多的问题，以前没有做过，还是菜鸟。请大家帮帮忙，在此先谢过！我遇到的问题有：
1、溶解效果不好：菌体加含8M的尿素的磷酸缓冲液后用超声波破菌，室温溶解1小时以上，甚至过夜溶解，溶解效果均很理想，虽然溶解了一部分，但是大多数还在沉淀里。我也做过含尿素梯度的缓冲液，我的目标蛋白在0.5M的尿素就有溶解，好像增加尿素的浓度对他的溶解影响不大一样，我想换用盐酸胍溶解，但是后面又要上柱子，不知道有没有影响，此外含盐酸胍的样品不能直接跑SDS-PAGE，所以很是郁闷。
2、Ni柱吸附样品不够好：将溶有我目标蛋白的样品上Ni柱进行纯化，但是上样前后的样品跑SDS-PAGE分析，没有多大的变化。纯化过程发现有很多的非特异性吸附。纯化后样品不够纯，大概只有50%。
3、纯度较高的浓度过低：由于要用于免疫，要求蛋白浓度要达到2mg/ml。但我的纯品很少，并且浓度过低，由于实验条件有限，浓缩样品又是一大难题。实验室没有冷冻干燥的装置，也不能用超滤，打算选用透析来浓缩，但是透析用的PEG会进入到样品中，这对免疫兔子影响是否会很大？会不会导致兔子死亡？有什么方法可以浓缩蛋白后将PEG去除？
4、此外是否可以用包含体的沉淀来免疫兔子？如果沉淀纯度够高的话
恳请高手们指教，盼回！谢谢！

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acui

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以前做过一部分包含体的复性，有如下几点建议，但愿对您有用：1、溶解效果不好：好多包含体的形成是因为在表达蛋白质的时候没有合适的氧化还原环境，所以会导致错配二硫键的形成，过多的错配S－S在包含体中，是不能简单通过高浓度尿素进行溶解的，需要8M尿素＋一定浓度的DTT（我用的是30mM，当然不同的包含体，可能DTT最佳浓度会有差别）才能溶解彻底，6M盐酸胍溶解效果要比8M尿素要好一些，但是没有DTT的话还是不行的，况且您好像后面还要电泳，若用盐酸胍会极大地影响电泳2、Ni吸附样品不够好：除了ni柱本身作为亲和纯化本身就特异性不够高的特点以外（Ni与His结合，好多杂蛋白如果有几个连续的His如溶菌酶什麽的也会结合在上面），个人以为：变性的蛋白质过Ni柱时，会对结果有影响（以前有师兄做过，就是His融合包含体蛋白在过镍柱时怎麽也结合不上去），后来怎麽也找不出原因3、纯度较高的浓度过低：建议除了透析浓缩之外，还可以尝试一下PEG浓缩蛋白个人认为这样可能会好一些4、个人认为是否：不可用包含体的沉淀来免疫兔子，但是可以用变性后的包含体蛋白来免疫兔子（好象要用8M尿素透析，除掉其它的变性液成分），这一点我个人没做过，但是同实验室的人做过，我也不知道为什麽他当时没有用包含体的沉淀而是溶解后再免疫Good Luck！

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biosepq

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变性后的蛋白更容易挂柱，因为与天然折叠状态相比，可以避免tag被包埋而无法与胶结合。但有时也需要还原剂协助打开，不同的柱子还原剂耐受性不同，有的可以耐受低浓度的还原剂。包含体蛋白用盐酸呱打开仍不挂柱应该是另有原因的，很多情况下都是天然状态下不挂柱，变性后就可以了。要是8MUrea都溶不了，可以用盐酸呱溶解样品，但buffer换成8MUrea，根据情况加适当还原剂。这样可以跑电泳。纯化的纯度不够，关键要进行优化，一般达到90%纯度还是可以的。最常见的就是咪唑梯度洗脱，还可以结合pH洗脱，有时可以用低浓度的detergent降低非特异性吸附，提高纯度。样品体积不大的浓缩用超滤离心管比较方便，几十块一个，可以反复用几次。

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fenghui234

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楼主：biosepq版主说得对，我针对Ni柱吸附样品不够好，补充一点：我觉得楼主最好加低浓度的咪唑如20mM来减少这种非特异性吸附。

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laboy

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1，尿素溶解不能长时间，会使包含体生产甲基化还是什么的变化，导致蛋白的性质和结构发生一定的变化，反而导致包含体不好溶解。建议还是用盐酸胍，6M的应该可以溶了，其他一些助溶的试剂和还原剂也加一点。2，尽量先选IDA的his亲和柱，亲和力大一点，先确保蛋白能被吸附，然后加滴浓度的米错，减少杂蛋白的干扰。如果杂蛋白实在是太多，可以试试NTA的，这个亲和力弱一点，也许能起到一定的分类筛选作用，一些菌体本身带少量组胺酸的蛋白不一定能吸附的住。3，包涵体免疫，小分子量的蛋白完全没有问题，大分子量的就不一定了，纯度7，80%也可以。就是不知道你后期的多抗纯化用什么手段，如果免疫的效果不是很理想，特异性的抗体占总抗体的比例不高，那用proteinA/G纯化出来的样品，可能会没法用

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laboy

用户

针对包涵体免疫再补充一些包涵体的沉淀只要研磨的足够细腻，其实免疫的效果可能更好，因为可以起到一定的缓释作用。溶解后也可以，溶解了的包涵体可以和佐剂充分互溶

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chromatography

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通常同配基密度IDA配基做填料的亲和带his标签要比NTA的强,而通常IDA作为配基的填料密度都要高于NTA,所以最强的是IDA.如果IDA挂不上,那NTA就更难说了.挂不大好用盐酸胍溶解样品是可以改善的.纯度关键看洗脱的条件.也可以换铜离子试试,不同金属离子选择有差别.

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laboy

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啊！！？？韦兄是我搞错了？好象NTA有4个亲和作用点，比IDA的3个多，是这样吗？如果排除配基密度的因素，那亲和力也是IDA大？

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chromatography

用户

所谓亲和位点是对镍离子而言,填料上螯合镍离子的价位越多可剩余的就少了,所以自然是Ni-IDA和蛋白的作用力强了.你可能把这两个强弱弄混了,没错,镍和NTA的作用力强,所以和蛋白作用力弱,而IDA正好相反.

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lilingrui

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谢谢各位的指点，我会加油，祝大家新年快乐！！

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lixwxwxw

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这位老兄你好，我帮师姐纯化蛋白时溶解包涵体也是用8M尿素，PH＝8.0的磷酸缓冲液，1克湿重的细菌加5～10ML的缓冲液，冰浴下置于摇床上裂解1小时，直到溶液澄清效果最好，后离心去沉淀。

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blueskey

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我的建议是,如果该调节的条件差不多都已经调节过了,但问题似乎并没有太大改观的话,就不要再浪费时间了,尤其对于读研的人来说,时间太宝贵了!赶快换用其他方法纯化.其实,通过切胶纯化的方法,即简单,得到的蛋白纯度又高,你不防试试.另,我自己的经验是,大多数蛋白都能在8M的尿素中比较好的溶解.我怀疑你所说的蛋白在8M的尿素中还有很多沉淀可能是超声不彻底的菌体,建议你把菌体超声彻底一些,有时超声时间不够或者强度不够都会影响超声效果.这一步很重要,也很费事,但切不可在这一步上偷工减料.

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blueskey

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如果你想通过切胶的方法纯化蛋白,我可以告诉你实验方法.

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blueskey

用户

应你的请求,我把实验方法贴在这里,希望对你有所帮助!(1)将收集的菌体超声破碎。(2)4℃18000rpm离心20min收集沉淀。(3)将沉淀溶于8M尿素中，加人适量6Xsamplebuffer，沸水煮10min变性蛋白。(4)将蛋白于8%的SDS-PAGE胶上电泳分离。(5)从胶的两边分别切一条胶，与速染液中染色约10min，脱色。其余胶置4℃存放。(6)比照染色的两边胶条，将未染色胶对应于目的蛋白的部分切下来，捣碎。(7)加入适量的10mMTris.HClbuffer（pH8.0），4℃摇床上摇摆过夜。(8)4℃12000rpm离心10min，收集上清。(9)取部分上清进行SDS-PAGE电泳，以鉴定回收的蛋白纯度。然后就可以对蛋白进行定量并免疫兔子了.

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山百合

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我觉得有一点你做错了。超声前菌体应悬浮在不含尿素的缓冲液里，然后超声、离心。这时的沉淀才是包含体，才能用含尿素的缓冲液溶解。溶解时可以冰浴并用磁力搅拌器搅拌促溶。然后离心去除不溶的东西，上清上柱。可以在做电泳时把不溶的沉淀一并电泳，如果还有你的目的蛋白，那超声时间就增加些。由于你的目标蛋白在0.5M的尿素就有溶解，那8M足够了，甚至可适当降低，纯化时也相应降低。按你说的那样做，我想你大部分的蛋白已经被扔掉了。

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lilingrui

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谢谢各位的指教，我现在正想用割胶的方法制备抗体了，真是感谢blueskey！救人于水深火热之中！！

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jingluo

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溶解用的缓冲液可以考虑尝试不同的PH，或者根据蛋白的等电点选用别的缓冲液

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