Activation of the zymogen, factor X, by either the intrinsic or extrinsic factor Xase complexes produces the active serine protease factor Xa (1,2). The activation of factor X requires proteolytic cleavage of the heavy chain, resulting in the release of an activation glycopeptide. The heavy chain region in factor Xa contains the serine protease catalytic domain, while the light chain, as in the zymogen, contains the membrane binding domain.
Factor Xa (molecular weight 46,000) participates in the prothrombinase complex, which catalyzes the rapid conversion of prothrombin to thrombin. Prothrombinase is an enzyme complex composed of factor Xa (enzyme) and factor Va (cofactor) assembled on a cellular surface in the presence of calcium ions. Although factor Xa can independently catalyze the activation of prothrombin, the rate at which this reaction occurs is increased nearly 300,000-fold with complete assembly of the prothrombinase complex. The clotting activity of factor Xa in vivo is terminated by either inactivation of the cofactor, factor Va, or by direct inhibition of factor Xa by inhibitors, such as ATIII, after disassembly of the prothrombinase complex.
In addition to its broad application in coagulation research, factor Xa can be utilized for site specific cleavage of fusion proteins expressed in bacteria (9-12). A factor Xa-sensitive site is incorporated between the recombinant protein of interest and peptides or proteins which facilitate purification and/or expression. The target protein is released from the expressed hybrid by cleavage with factor Xa. The factor Xa can then be easily removed by affinity chromatography.
Factor Xa is prepared by activating purified factor X with the factor X activator isolated from Russell"s viper venom. Factor Xa is purified from the activation mixture by chromatography over benzamidine-Sepharose followed by gel filtration (1,3). Several modified forms of factor Xa are also available including: A) active-site blocked factor Xa containing either the tripeptide chloromethyl ketone inhibitor EGRck, or the fluorescent inhibitor Dansyl-EGRck; and B) human Gla-domainless β-factor Xa. The enzyme is supplied in 50% (vol/vol) glycerol/H2O and should be stored at -20°C. Purity is determined by SDS-PAGE analysis and activity is measured in a factor Xa clotting assay and/or chromogenic substrate assay. Lot to lot consistency ensures reproducible results every time.
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看了下说明书，上面没有具体说。感觉捕获抗体和酶标抗体需要对HCP有不同的结合位点才能形成稳定的抗体-HCP-抗体复合物。不知道有没有战友熟悉，求解惑，谢谢！
一抗的英语是 resistance No.1，二抗resistance No.2.
（一）包被用抗原
用于包被固相载体的抗原按其来源不同可分为天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。天然抗原可取自动物组织、微生物培养物等，须经提取纯化才能作包被用。如HBsAg可以从携带者的血清中提取，一般的细菌和病毒抗原可以从其培养物中提取，蛋白成份抗原可从富含此抗原的材料中提取等（例如AFP从脐带血或胎肝中提取）。重组抗原是抗原基因在质粒体中表达的蛋白质抗原，多以大肠杆菌或酵母菌为质粒体。重组抗原的优点是除工程菌成份外，其他杂质少，而且无传染性，但纯化技术难度较大。以大肠杆菌为质粒体的重组抗原如不能充分除大肠杆菌成份，用于ELISA试剂盒，在反应中可出现假阳性，因不少受检者受大肠杆菌感染而在血清中存在抗大肠杆菌抗体。重组抗原的另一特点是能用基因工程制备某些无法从天然材料中分离的抗原物质。例如丙型肝炎病毒（HCV）尚不能培养成功，而且丙肝病人血清中HCV抗原含量极微。目前检测抗HCVELISA中所用包被抗原大多为根据HCV的基因克隆表达而制备的重组抗原。在传染病诊断中，不少重组抗原如HBsAg、HBeAg和HIV抗原等均在ELISA中取得应用。合成多肽抗原是根据蛋白质抗原分子的某一抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。多肽抗原一般只含有一个抗原决定簇，纯度高，特异性也高，但由于分子量太小，往往难于直接吸附于固相上。多肽抗原的包被一般需先使其与无关蛋白质如牛血清白蛋白质（BSA）等偶联，借助于偶联物与固相载体的吸附，间接地结合到固相载体表面。应用多肽抗原的另一注意点为他仅能检测与其相应的抗体。一种蛋白质抗原往往含有多个不同的能引起抗体产生的决定簇，因此在受检血清中的其他抗体就不能与该多肽抗原发生反应。另外，某些微生物发生变异时往往发生抗原结构变化，在这种情况下，用个别多肽抗原进行包被可引起其他抗体的漏检。
（二）ELISA试剂盒包被用抗体
包被固相载体的抗体应具有高亲和力和高特异性，可取材于抗血清或含单克隆抗体的腹水或培养液。如免疫用抗原中含有杂质（即便是极微量的），在抗血清中将出现杂抗体，必须除去（可用吸收法）后才能用于ELISA，以保证试验的特异性。抗血清不能直接用于包被，应先提取IgG，通常采用硫酸铵盐析和Sephadex凝胶过滤法。一般经硫酸铵盐析粗提的IgG已可用于包被，高度纯化的IgG性质不稳定。如需用高亲和力的抗体包被以提高试验的敏感性，则可采用亲和层析法以除去抗血清中含量较多的非特异性IgG。腹水中单抗的浓度较高，特异性亦较强，因此不需要作吸收和亲和层析处理，一般可将腹水作适当稀释后直接包被，必要时也可用纯化的IgG。应用单抗包被时应注意，一种单抗仅针对一种抗原决定簇，在某些情况下，用多种单抗混合包被，可取得更好的效果。展开
C、如果检测的指标数目超过了流式细胞仪的通道，怎么办？如果需要做5个指标，而流式细胞仪只能做4个通道，首先将指标归成2类，再将样本分成2份，分别检测。比如需要同时检测CD3、CD4、CD8、IL-4和IFN-gamma，那么将样本分成两份，第1份加CD3、CD4、CD8和IL-4，而第2份加CD3、CD4、CD8和IFN-gamma。
二、同型对照（IsotypyControl）1、为什么要用同型对照？同型对照是使用与一抗相同种属来源、相同亚型、相同剂量和相同的免疫球蛋白及亚型的免疫球蛋白，用于消除由于抗体非特异性与细胞结合而产生的背景染色。同型对照是真正意思上的阴性对照，它不但可以用来设定流式细胞仪的电压，而且还可以帮忙省去昂贵与繁琐的重组细胞因子竞争封闭步骤。在流式细胞仪上样前，染色方式如下：样本管：一抗＋样本同型对照管：同型对照＋样本
2、如何选择同型对照？一般选择与一抗的成分完全相同种属来源、相同亚型和亚链、相同荧光标记的抗体，比如抗人的CD56APC标记的抗体，货号是555518,成份是MouseIgG1,κ。那么它的同型对照应该是APC标记的MouseIgG1,κ，货号是555751。注意同型对照的成份跟它的名称是相同的.如果是抗体的组合形式是纯化的一抗＋荧光标记的二抗，那么应该选择一抗的同型对照。比如CDw125的纯化抗体，货号是555901，成分是MouseIgG1,κ。它的同型对照是纯化的MouseIgG1,κ，货号是555746。它的二抗PE标记的抗小鼠IgG1,货号是550083。那么染色方式如下：样本管：纯化的CDw25＋PE标记的抗MouseIgG1＋样本同型对照管：纯化的同型对照＋PE标记的抗MouseIgG1＋样本
如果没有找到适合的同型对照，在保持来源相同、荧光标记相同、免疫球蛋白类别相同条件下，那么优先选择的顺序应该是亚链不同－－亚型不同－－相同类别。比如，某种的抗体的来源是MouseIgG2а,κ。如果在同型对照表里面找到不到完全相同的同型对照，那么优先选择相同荧光标记的MouseIgG2а为同型对照。如果也没有找到MouseIgG2а，那么优先选择相同荧光标记的MouseIgG2b作为同型对照。如果最后还是没有找到MouseIgG2b，那么选者相同荧光标记的MouseIgG2作为同型对照。
3、如何查找同型对照？同型对照在BD英文目录中或者BD网站上跟它对照的抗体的位置是一致的。BD目录中，抗人的抗体的同型对照都在HUMAN章节后面。抗小鼠的抗体的同型对照在MOUSE章节后面，非人类灵长类的抗体同型对照在NONHUMANPRIMATE章节后面。由于抗大鼠的抗体非常少，大部分抗体都是小鼠来源的，所以它的同型对照跟小鼠的一样，放在MOUSE章节后面。胞内细胞因子、趋化因子、补体、炎症介质及其受体的同型对照放在其章节的后面（注意：人的胞内细胞因子的同型对照跟人的表面标志的同型对照是不在一起的）。Phosflow的同型对照在Phosflow的介绍后面。比如，比如抗人的CD56APC标记的抗体，货号是555518，在06版BD目录的169页，成份是MouseIgG1,κ。那么它的同型对照应该是在HUMAN章节中MouseImmunoglobulinIsotype表格中，第191页，APC标记的MouseIgG1,κ，货号是555751。
4、哪些客户需要使用同型对照？A对流式不是非常熟悉的客户。B做胞内流式客户，比如胞内细胞因子、趋化因子和信号蛋白等。C使用不常见的标志或者特异性不高的标志的客户，因为客户不熟悉不常见标志的表达情况，根据同型对照可以判断阳性细胞的位置。一些特异性不高的抗体，如多抗，非特异性结合非常多，使用同型对照可排除假阳性。D对流式非常熟悉又使用常用的表面标志的客户一般可以不使用同型对照。
5、为什么有时候同型对照的表达会比抗体的表达高？首先需要检查同型对照的抗体是否加错类型、剂量等。其次，因为有些标志在细胞的表面或者胞内表达不高，而跟其类似的抗原非常多，那么加入同型对照时，同型对照非特异性的结合会超过抗体的特异性，所以会造成这种现象，在细胞表面时如图所示。这个时候推荐使用其他阴性对照，如空白对照等。
三、补偿微球流式细胞仪的荧光补偿隔一段时间之后需要调整到适合的位置。如果荧光补偿没有调节好，会导致细胞分群不明显或者流式检测得到的结果图非常不漂亮，而且会影响到检测结果的不真实。荧光补偿的调节对初学者来说非常不容易掌握，同时，补偿调节是流式细胞术中比较难掌握的操作。尤其是一些不常见的标志检测时，需要经验非常丰富的流式操作者根据多年的经验判断调节补偿，才可以得到比较好的数据和图片。那么，现在不需要这么麻烦。因为补偿微球让一切变得更简单。BDCompBeads是专用于流式细胞仪多色分析的荧光补偿调整微球。它的实用性是在于克服了以往普通的做三色以上的流式分析时补偿难调、耗费样本（往往用待测样本单标来进行补偿调节）的缺点。它本身不携带任何荧光，借助于与客户自己的特异性荧光抗体孵育结合来调节补偿。它不但能象待测的样本细胞一样在同样的实验条件下固定、破膜等，操作起来很简单，灵敏度高，一致性好，使补偿更轻松更准确，而且最难得的是它最适合于多色分析（如五色、六色、七色等）和复合荧光素（如PE-Cy7、APC-Cy7等），因为这时的补偿往往难度较大。各型号的流式仪器均能使用。Compbeads使用后可以将流式的条件保存，方便下次做同样的荧光染色搭配时参考用。
液体的一抗加50%甘油，-20度也不会冻结，可保存3-5年；
经常使用时取出一小份，4度可使用半年之久；
粉末状的二抗直接-20或-80度贮藏就行了。
