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Full Moon/Kinase Antibody Array/AVK276
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Kinase Antibody Array
Kinase Antibody Array is a high-throughput ELISA based antibody array for qualitative/semi-quantitative protein expression profiling. This array includes antibodies from the kinase families AGC, CAMK, CK1, CMGC, STE, TK, and TKL. It is suitable for comparing normal samples to treated or diseased samples, and identifying candidate biomarkers.
Key Features
- Qualitative/semi-quantitative protein expression profiling
- Suitable samples: cell lysates; frozen or FFPE tissue lysates; serum; culture media
- Glass based array with high specificity and low background
- Antibodies are covalently attached to 3D polymer coated glass slides
- Sensitive fluorescent detection
User’s Guide
Antibody Array User’s Guide
Product Details
| Number of Antibodies: | 276 kinase related antibodies AGC (33); CAMK (24); CK1 (4); CMGC (35); STE (17); TK (52); TKL (19) |
| Number of Replicates: | 6 replicates per antibody |
| Targets: | Antibody List |
| Reactivity: | Human |
| Internal Controls: | beta-actin; GAPDH; Negative controls |
| Detection Method: | Fluorescence; Compatible Scanners |
| Slide dimensions: | 76 x 25 x 1 mm |
| Product Size: | 2 array slides per package for analyzing two samples (control vs. treated) |
| Storage Condition: | 4°C for 6 months |
Additional Reagent Needed:
Antibody Array Assay Kit
$350.00
美国FullMoonBioSystems公司成立于2001年，专注于蛋白组研究的创新研究，其特色的蛋白芯片产品的所有抗体都通过专利的3-D聚合材料固定在高质量的玻片表面，从而确保抗体芯片产品高度的有效性和特异性。芯片上包含经过验证的抗体、阳性参照、阴性参照等。为了增大数据的可信度，每个抗体都进行了六次重复.产品及服务特点适用于高通量蛋白表达研究 高度优质的原料抗体专利的3-D聚合材料芯片片基高度特异性，信号强，低背景噪音蛋白的标记、检测方便可行，常用的芯片扫描仪样品用量少：每个检测只需要5μg蛋白真实样品和比例：组织细胞全部的直接裂解物，无需提纯，非变性：真实比例，天然构象聚焦信号通路：每个芯片集中特定信号传导通路，采用精选的优质抗体六次重复，保证数据的稳定性标准规格的芯片：方便实验和扫描适用普通芯片扫描仪应用范围 高质量的蛋白质表达谱分析检测蛋白表达水平的变化(正常vs.病理、正常vs.药物处理）识别候选标志物大多数芯片同时适用于人、大鼠、小鼠
蛋白质作为生物功能的直接执行者，其表达水平的改变能直接地影响着生命体生物功能的发挥。因此，找到关键实验样本中表达水平发生变化的关键蛋白是科学研究的重要切入点。 蛋白表达抗体芯片——充分结合了生物芯片技术高通量优点和抗原/抗体反应敏感性和特异性原理，实现了蛋白质表达水平的精确高通量筛选。相比传统的Western Blot、ELISA、IHC等研究手段，抗体芯片可以一次性对上千种蛋白质的表达量进行定性定量地检测，在提高工作效率的同时，更能节省宝贵的样品。 相比蛋白质谱技术，抗体芯片的抗原/抗体反应原理与WesternBlot等技术更加接近，因此，抗体芯片检测出的差异蛋白重现性比蛋白质谱更高。同时，针对细胞因子等分泌型蛋白，抗体芯片的灵敏度更高。对于血清/血浆样品的检测，抗体的特异性很大程度地避免了高丰度蛋白的影响，检测精度较蛋白质谱要更高。 苏州蚂蚁淘生物医药科技有限公司提供种类丰富的蛋白表达抗体芯片产品及技术服务，既包括蛋白质广谱筛选抗体芯片，也包括特定类型蛋白的表达检测抗体芯片，如：细胞因子抗体芯片、趋化因子抗体芯片、炎症因子抗体芯片、生长因子抗体芯片、血管生成因子抗体芯片、基质金属蛋白酶抗体芯片、脂联因子抗体芯片等。
抗体芯片种类：抗体芯片特点： 50uL的液质样本、200ug的总蛋白量即可完成多指标检测；适用于血清/浆、培养上清及细胞、组织裂解液等多种生物样本；可以有效避免采用传统方法所引入的批次间实验误差；扩大单个样本的信息量并可做不同分析物间的交互分析。 抗体芯片原理： 抗体芯片文献：Izzotti A, et al. Relationships between pulmonary microRNA and proteome profiles, systemic cytogenetic damage and lung tumors in cigarette smoke-exposed mice treated with chemopreventive agents. Carcinogenesis, 2013, 34(10): 2322-2329.Straussman R, et al. Tumour microenvironment elicits innate resistance to RAF inhibitors through HGF secretion. Nature, 2012, 487(7408): 500-504.Bagnis A, et al. Aqueous humor oxidative stress proteomic levels in primary open angle glaucoma. Exp Eye Res, 2012, 103: 55-62.Moon K M, et al. The effect of secretory factors of ADIpose-derived stem cells on human keratinocytes. Int J Mol Sci, 2012, 13(1): 1239-1257.Saccà S C, et al. New proteins as vascular bioMarkers in primary open angle glaucomatous aqueous humor. Invest Ophth Vis Sci, 2012, 53(7): 4242-4253.Yalcin A, et al. Nuclear targeting of 6-phosphofructo-2-kinase (PFKFB3) increases proliferation via cyclindependent kinases. J Bio Chem,2009, 284(36): 24223-24232.Tang Y L, et al. Hypoxic preconditioning enhances the benefit of cardiac Progenitor cell therapy for treatment of myocardial infarction by inducing CXCR4 expression. Circ Res, 2009, 104(10): 1209-1216.
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2018-12-26
及的具体步骤最终取决于样品的性质。但也有共同可参考的阶段 捕获阶段：目标是澄清、浓缩和稳定目标蛋白。 中度纯化阶段：目标是除去大多数大量杂质，如其它蛋白、核酸、内毒素和病毒等。 精制阶段：除去残余的痕量杂质和必须去除的杂质。分离方法的选择 根据蛋白质的特殊性质采用不同的分离 查看更多
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2018-12-26
Purification of Ncd Motor Domain ProteinMaterials Induced cells (2 - 5 g pellet of pET/Ncd in BL21(DE3)pLysS host cells)HEM buffer = 10 mM HEPES pH 7.21 mM DTT 查看更多
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2018-12-26
蛋白的复性是一个世界性的难题，没有通用的方法，甚至没有靠得住的规律，只能试。可以参考以下文章。该文出处已经忘了，如果有人知道原创作者或网上出处，请补充。包涵体表达的蛋白的复性包涵体表达的蛋白的复性包涵体：包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。包涵 查看更多
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2021-09-21
虽然亲和层析法是进行特异性抗体纯化的首选，然而有时这种纯化方式却非必需，或者无法实施进行。在大多数锖况下，运铁蛋白可发生共沉淀或共纯化，能用凝胶滤过层析去除之。 查看更多
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2018-12-26
HP-RPC的选择首先要看蛋白质的分子量，20kDa左右的一般用C4或C8，再小一点的可以用C18，太大的蛋白并不适于反相分离。C18通用性最好，但是有时候保留过强可能会导致收率较低。如果目的蛋白不是很针对，可以考虑通用性最强的C18柱。一般来说，4.6mm的内径比较常见，250mm长的柱子比150mm的柱子分离度要 查看更多
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2021-08-10
抗体作为生物学上的一个有用工具已经超过一个世纪。 1 9 世 纪 7 0 年 代 ， Emil vonBehring 和 Shibasaburo Kitasato⑴最先阐述了免疫球蛋白，从那时起，抗体在研究和商业应用方面的使用取得了前所未有的进展。抗体最初是作为治疗病毒性疾病的天然抗血清来使用的。现今，高度工程化的治疗性抗体已被用于治疗多种危及生命的疾病。这一章将介绍纯化抗体的几种方法，尤其是单克隆抗体的纯化，纯化后的单克隆抗体具有多种用途。本章还将介绍抗体纯化前后的鉴定学方法。本章中，我们实验室产生的数 查看更多
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GE Healthcare品牌特约代理商/现货 查看更多
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2018-12-26
Isolation of live bacteria from adult insectsHoracio M Frydman , hfrydman@princeton.edu, Associate Researcher Manuscript: 2005-11-13631BJournal: NatureArticle 查看更多
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膜蛋白在生物进程中具有关键性的作用。它们参与细胞与细胞之间、细胞与细胞基质 之 间 的 相 互 联 系 胞 器 及 细 胞 的 形 成 过 程 ，各种离子、代谢产物和蛋白质的跨质膜运辅 i，R N A 的跨核膜运输等。鉴于膜蛋白在多种细胞功能中的重要性，目前针对各种疾病的药物约有 5 0 % 都以其为靶点。作者： 伯吉斯等,主译：陈薇，本实验来自「蛋白质纯化指南」 查看更多
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辛酸提取法可用于分离提取人、兔、小鼠血清中的Ig及杂交瘤诱生的腹水和培养上清液中McAb。 查看更多
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2021-07-19
蛋白质表达、分离、纯化可以：（1）探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理；（2）供作结构与功能的研究；（3）作为催化剂、营养剂等。 查看更多
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2021-08-27
从自然环境中分离和纯化噬菌体实验的相关实验步骤、实验技巧、实验protocol、实验经验及常见问题。<link rel="stylesheet" type="text/css" href="/ueditor/themes... 查看更多
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常见问题
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求助:冰冻切片做免疫荧光的一些问题?非常感谢 免疫学讨论版...123
shamoyecao2021-08-08
请教各位大咖，冰冻切片做免疫荧光染色二抗如果放37度l小时，切片会不会干掉，细节应该怎么做。如果二抗室温（现在室内13度）1小时够不够，我是二抗室温lh染了2次，都没有满意的荧光。还有病理科的老师说冰冻切片之前不能固定，我是直接新鲜组织OCT包埋后冰冻切片的
细胞免疫组化(SABC法)123
gopwfsycre2021-08-11
免疫组化检测小鼠组织抗原表达情况时,采用免疫组化用纯化抗体（小鼠）进行抗原抗体反应,纯化小鼠抗体通常有多个表位,除去和抗原反应的表位外,还可以有一个表位结合羊抗小鼠IgG,在羊抗小鼠IgG上面连上生物素,可以通过SABC法进行生物素显色,根据显色情况来判断抗原的表达水平,属于间接检测法.该方法比较灵敏,但是实验过程条件太多,容易出现假阳性……
怎么样正确的进行ELISA试剂盒的检测 123
小灰机7692021-07-28
最全的ELISA试剂盒说明书在这里（通用版）
规格：96T 48T
用途：科研实验（仅供实验室研究使用）
保存：2-8℃。
有效期：6个月
结合物的制备
1. 戊二醛交联法
戊二醛是一种双功能团试剂，它可以使酶与蛋白质的氨基通过它而联结。碱性磷酸一般用此法进行标记。交联方法一步法、两步法两种。在一步法中戊二醛直接加入酶与抗体的混合物中，反应后即得酶标记抗体。
ELISA中常用的酶一般都用此法交联。它具有操作简便、有效和重复性好等优点。缺点是交联反应是随机的，酶与抗体交联时分子间的比例不严格，结合物的大小也不均一，酶与酶，抗体与抗体之间也有可能交联，影响效果。在两步法中，先将酶与戊二醛作用，透析除去多余的戊二醛后，再与抗体作用而形成酶标抗体。也可先将抗体与戊二醛作用，再与酶联结。两步法的产物中绝大部分的酶与蛋白质是以1:1的比例结合的，较一步法的酶结合物更有助于本底的改善以提高敏感度，但其偶联的有效率较一步法低。
2. 过碘酸盐氧化法：本法只适用于含糖量较高的酶。辣根过氧化物酶的标记常用此法。反应时，过碘酸钠将HRP分子表面的多糖氧化为醛基很活泼，可与蛋白质上的氨基形成Schiff氏碱而结合。酶标记物按克分子比例联结，其最佳比例为：酶/抗体=1-2/1。此法简便有效，一般认为是HRP最可取的标记方法，但也有人认为所有试剂较为强烈，各批实验结果不易重演。
按以上方法制备的酶结合物一般都混有未结合物的酶和抗体。理论上，结合物中混有的游离酶一般不影响ELISA中最后的酶活性测定，因经过彻底洗涤，游离酶可被除去，并不影响最终的显色。但游离的抗体则不同，它会与酶标抗体竞争相应的固相抗原，从而减少了结合到固相上的酶标抗体的量。因此制备的酶结合物应予纯化，去除游离的酶和抗体后用于检测，效果更好。纯化的方法很多，分离大分子化合物的方法均可应用。硫酸铵盐析法最为简便，但效果并不理想，因为此法只能去除留在上清中的游离酶，但相当数量的游离抗体仍与酶结合物一起沉淀而不能分开。用离子交换层析或分子筛分离更为可取，高效液相层析法可将制备的结合物清晰地分成三个部分：游离酶、游离抗体和纯结合物而取得最佳的分离效果，但费用较贵。
结合物制得后，在用作ELISA试剂前尚需确定其适当的工作浓度。使用过浓的结合物，既不经济，又可使本底增高；结合物的浓度过低，则又影响检测的敏感性。所以必须对结合物的浓度予以选择。最适的工作浓度就是指结合物稀释至这一浓度时，能维护一个低的本底，并获得测定的最佳灵敏度，达到最合适的测定条件和测定费用的节省。就酶标抗体本身而言，它的有效工作浓度是指与其相应抗原包被的载体作试验时，能得到阳性反应的最高稀释度。例如某一HRP：抗人IgG制剂标明的工作浓度为1:5000，表示该制剂经1:5000稀释后，在与人IgG包被的固相作ELISA试验时，将发生阳性反应。但在用于具体的ELISA检测中，酶标抗体的最适工作浓度受到固相载体的性质、包被抗原或抗体的纯度以及整个检测系统如标本、反应温度和时间等的影响，因此必须在实际测定条件下进行"滴配"选择能达到高敏感度的最大稀释度作为试剂盒中的工作浓度。
结合物的保存
酶标抗体中的酶和抗体均为生物活性物质，保存不当，极易失活。高浓度的结合物较为稳定，冰冻干燥后可在普通冰箱中保存一年左右，但冻干过程中引起活力的减低，而且使用时需经复溶，颇为不便。结合物溶液中加入等体积的甘油可在低温冰箱或普通冰箱的冰格中较长时间保存。早期的ELISA试剂盒中的结合物一般均按以上两种形式供应，配以稀释液（见3.2.5）临用时按标明的稀释度稀释成工作液。现在较先进的ELISA试剂盒均已用合适的缓冲液配成工作液，使用时不需再行稀释，在4-8℃保存期可达6个月。由于蛋白质浓度较低，结合物易失活，需加入蛋白保护剂。另外再加入抗生素（例如庆大霉素）和防腐剂（HRP结合物加硫柳泵，AP结合物可加叠氮钠），以防止细菌生长。
结合物的稀释液
用于稀释高浓度的结合物以配成工作液。为避免结合物在反应中直接吸附在固相载体上，在稀释缓冲液中常加入高浓度的无关蛋白质（例如1%牛血清白蛋白），通过竞争以抑制结合物的吸附。一般还加入具有抑制蛋白质吸附于塑料表面的非离子型表面活性剂，如吐温20，0.05%的浓度较为适宜。在间接测定抗体时，血清标本需稀释后进行测定，也可应用这种稀释液。
试剂盒组成
标本要求
1. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融
2. 不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
操作步骤
1. 标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。
2. 加样
分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3. 温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
4. 配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用
5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
6. 加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。
7. 温育：操作同3。
8. 洗涤：操作同5。
9. 显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.
10. 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
11. 测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。
操作程序总结：
计算
以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
注意事项
1. 试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。
2. 浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。
3. 各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。
4. 请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。
5. 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6. 底物请避光保存。
7. 严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.
8. 所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。
9. 本试剂不同批号组分不得混用。
洗涤液
在板式ELISA中，常用的稀释液为含0.05%吐温20磷酸缓冲盐水。
酶反应终止液
常用的HRP反应终止液为硫酸，其浓度按加量及比色液的最终体积而异，在板式ELISA中一般采用2mol/L。
阳性对照品和阴性对照品
阳性对照品和阴性对照品是检验试验有效性的控制品，同时也作为判断结果的对照，因此对照品，特别是阳性对照品的基本组成应尽量与检测标本的组成相一致。以人血清为标本的测定，对照品最好也为人血清，因为正常人血清在各种ELISA模式中可产生不同程度的本底。由于大量正常人血甭较难得到，国外试剂盒中的对照品多以复钙人血浆为原料，即在血浆中加入钙离子，使其中的纤维蛋白质凝固，除去凝块后所得的液体，其组成与血清相似。阴性对照品须先行检测，确定其中不含待测物质。例如HBsAg检测的阴性对照品中不可含HBsAg，最好抗HBs也是阴性。阳性对照品多以含蛋白保护剂的缓冲液为基质，其中加入一定量的待检物质，此量最好在试剂说明书中标明。加入的量应与试剂的敏感度相称，在测定中得到的吸光值与受检标本吸光值比较，可对标本中受检物质的量有一个粗略的估计。国外检测HBsAg的ELISA试剂盒检测敏感度约为0.5ng/ml，阳性对照品中含量约为10ng/ml。在对照品中一般加入抗生素和防腐剂，以利保存。
包被用抗体
包被固相载体的抗体应具有高亲和力和高特异性，可取材于抗血清或含单克隆抗体的腹水或培养液。如免疫用抗原中含有杂质（即便是极微量的），在抗血清中将出现杂抗体，必须除去（可用吸收法）后才能用于ELISA，以保证试验的特异性。抗血清不能直接用于包被，应先提取IgG，通常采用硫酸铵盐析和Sephadex凝胶过滤法。一般经硫酸铵盐析粗提的IgG已可用于包被，高度纯化的IgG性质不稳定。如需用高亲和力的抗体包被以提高试验的敏感性，则可采用亲和层析法以除去抗血清中含量较多的非特异性IgG。腹水中单抗的浓度较高，特异性亦较强，因此不需要作吸收和亲和层析处理，一般可将腹水作适当稀释后直接包被，必要时也可用纯化的IgG。应用单抗包被时应注意，一种单抗仅针对一种抗原决定簇，在某些情况下，用多种单抗混合包被，可取得更好的效果。
包被的条件
包被用抗原或抗体的浓度，包被的温度和时间，包被液的pH等应根据试验的特点和材料的性质而选定。抗体和蛋白质抗原一般采用pH9.6的碳酸盐缓冲液作为稀释液，也有用pH7.2的磷酸盐缓冲液及pH7~8的Tris-HCL缓冲液作为稀释液的。通常在ELISA板孔中加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置过夜，37℃中保温2小时被认为具有同等的包被效果。包被的最适当浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化，每批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定。一般蛋白质的包被浓度为100ng/ml-20ug/ml。
包被的方式
将抗原或抗体固定在过程称为包被。换言之，包被即是抗原或抗体结合到固相载体表面的过程。蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用于。这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。载体对不同蛋白质的吸附能力是不相同的，大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体表面。 IgG对聚苯乙烯等固相具有较强的吸附力，其联结多发生在Fc段上，抗体结合点暴露于外，因此抗体的包被一般均采用直接吸附法。蛋白质抗原大多也可采用与抗体相似的方法包被。当抗原决定簇存在于或邻近于疏水区域时，抗原与固相载体的直接吸附可使抗原决定簇不能充分暴露，在这种情况下，直接包被效果不佳，可以采用间接的捕获包被法，即先将针对该抗原的特异抗体作预包被，其后通过抗原抗体反应使抗原固相化。此间接结合在固相上的抗原远离载体表面，其抗原决定簇也得以充分暴露。间接包被的抗原经固相抗体的亲和层析作用，包被在固相上的抗原纯度大大提高，因此含杂质较多的抗原也可采用捕获包被法，试验的特异性、敏感性均由此得以改善，重复性亦佳。间接包被的另一优点是抗原用量少，仅为直接包被的1/10乃至于/100。不易吸附在聚苯乙烯载体上的非蛋白质抗原可采用特殊的包被方式。例如，在检测抗DNA抗体时，需用DNA作为包被抗原，而普遍的固相载体一般不能直接与核酸结合。可将聚苯乙烯板先经紫外线照射，以增加其吸附性能。固相载体先用碱性蛋白质，如聚赖氨酸、鱼精蛋白等作预包被，也可提高核酸的结合力。也可用亲和素生物素系统作间接包被，即用亲和素先包被载体，然后加入生物素化的DNA，这种包被方法均匀、牢固，已扩大应用于各种抗原物质的定量测定。
脂类物质无法与固相载体结合，可将其在有机溶剂中溶解后加入ELISA板孔中，开盖置冰箱过夜或冷风吹干，待酒精挥发后，让脂质自然干固在固相表面。抗心磷脂抗体的ELISA试剂一般采用这种包被方式。
洗板方法：
1. 手工洗板方法：吸去或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液至少0.3ml注入孔内，浸泡1-2分钟，根据需要，重复此过程数次。
2. 自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。待检样本：体液、血清、血浆、细胞培养上清液、尿液、组织匀浆、心房水标本等
规格：96T 48T
用途：科研实验（仅供实验室研究使用）
保存：2-8℃。
有效期：6个月
结合物的制备
1. 戊二醛交联法
戊二醛是一种双功能团试剂，它可以使酶与蛋白质的氨基通过它而联结。碱性磷酸一般用此法进行标记。交联方法一步法、两步法两种。在一步法中戊二醛直接加入酶与抗体的混合物中，反应后即得酶标记抗体。
ELISA中常用的酶一般都用此法交联。它具有操作简便、有效和重复性好等优点。缺点是交联反应是随机的，酶与抗体交联时分子间的比例不严格，结合物的大小也不均一，酶与酶，抗体与抗体之间也有可能交联，影响效果。在两步法中，先将酶与戊二醛作用，透析除去多余的戊二醛后，再与抗体作用而形成酶标抗体。也可先将抗体与戊二醛作用，再与酶联结。两步法的产物中绝大部分的酶与蛋白质是以1:1的比例结合的，较一步法的酶结合物更有助于本底的改善以提高敏感度，但其偶联的有效率较一步法低。
2. 过碘酸盐氧化法：本法只适用于含糖量较高的酶。辣根过氧化物酶的标记常用此法。反应时，过碘酸钠将HRP分子表面的多糖氧化为醛基很活泼，可与蛋白质上的氨基形成Schiff氏碱而结合。酶标记物按克分子比例联结，其最佳比例为：酶/抗体=1-2/1。此法简便有效，一般认为是HRP最可取的标记方法，但也有人认为所有试剂较为强烈，各批实验结果不易重演。
按以上方法制备的酶结合物一般都混有未结合物的酶和抗体。理论上，结合物中混有的游离酶一般不影响ELISA中最后的酶活性测定，因经过彻底洗涤，游离酶可被除去，并不影响最终的显色。但游离的抗体则不同，它会与酶标抗体竞争相应的固相抗原，从而减少了结合到固相上的酶标抗体的量。因此制备的酶结合物应予纯化，去除游离的酶和抗体后用于检测，效果更好。纯化的方法很多，分离大分子化合物的方法均可应用。硫酸铵盐析法最为简便，但效果并不理想，因为此法只能去除留在上清中的游离酶，但相当数量的游离抗体仍与酶结合物一起沉淀而不能分开。用离子交换层析或分子筛分离更为可取，高效液相层析法可将制备的结合物清晰地分成三个部分：游离酶、游离抗体和纯结合物而取得最佳的分离效果，但费用较贵。
结合物制得后，在用作ELISA试剂前尚需确定其适当的工作浓度。使用过浓的结合物，既不经济，又可使本底增高；结合物的浓度过低，则又影响检测的敏感性。所以必须对结合物的浓度予以选择。最适的工作浓度就是指结合物稀释至这一浓度时，能维护一个低的本底，并获得测定的最佳灵敏度，达到最合适的测定条件和测定费用的节省。就酶标抗体本身而言，它的有效工作浓度是指与其相应抗原包被的载体作试验时，能得到阳性反应的最高稀释度。例如某一HRP：抗人IgG制剂标明的工作浓度为1:5000，表示该制剂经1:5000稀释后，在与人IgG包被的固相作ELISA试验时，将发生阳性反应。但在用于具体的ELISA检测中，酶标抗体的最适工作浓度受到固相载体的性质、包被抗原或抗体的纯度以及整个检测系统如标本、反应温度和时间等的影响，因此必须在实际测定条件下进行"滴配"选择能达到高敏感度的最大稀释度作为试剂盒中的工作浓度。
结合物的保存
酶标抗体中的酶和抗体均为生物活性物质，保存不当，极易失活。高浓度的结合物较为稳定，冰冻干燥后可在普通冰箱中保存一年左右，但冻干过程中引起活力的减低，而且使用时需经复溶，颇为不便。结合物溶液中加入等体积的甘油可在低温冰箱或普通冰箱的冰格中较长时间保存。早期的ELISA试剂盒中的结合物一般均按以上两种形式供应，配以稀释液（见3.2.5）临用时按标明的稀释度稀释成工作液。现在较先进的ELISA试剂盒均已用合适的缓冲液配成工作液，使用时不需再行稀释，在4-8℃保存期可达6个月。由于蛋白质浓度较低，结合物易失活，需加入蛋白保护剂。另外再加入抗生素（例如庆大霉素）和防腐剂（HRP结合物加硫柳泵，AP结合物可加叠氮钠），以防止细菌生长。
结合物的稀释液
用于稀释高浓度的结合物以配成工作液。为避免结合物在反应中直接吸附在固相载体上，在稀释缓冲液中常加入高浓度的无关蛋白质（例如1%牛血清白蛋白），通过竞争以抑制结合物的吸附。一般还加入具有抑制蛋白质吸附于塑料表面的非离子型表面活性剂，如吐温20，0.05%的浓度较为适宜。在间接测定抗体时，血清标本需稀释后进行测定，也可应用这种稀释液。
试剂盒组成
标本要求
1. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融
2. 不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
操作步骤
1. 标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。
2. 加样
分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3. 温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
4. 配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用
5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
6. 加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。
7. 温育：操作同3。
8. 洗涤：操作同5。
9. 显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.
10. 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
11. 测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。
操作程序总结：
计算
以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
注意事项
1. 试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。
2. 浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。
3. 各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。
4. 请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。
5. 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6. 底物请避光保存。
7. 严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.
8. 所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。
9. 本试剂不同批号组分不得混用。
洗涤液
在板式ELISA中，常用的稀释液为含0.05%吐温20磷酸缓冲盐水。
酶反应终止液
常用的HRP反应终止液为硫酸，其浓度按加量及比色液的最终体积而异，在板式ELISA中一般采用2mol/L。
阳性对照品和阴性对照品
阳性对照品和阴性对照品是检验试验有效性的控制品，同时也作为判断结果的对照，因此对照品，特别是阳性对照品的基本组成应尽量与检测标本的组成相一致。以人血清为标本的测定，对照品最好也为人血清，因为正常人血清在各种ELISA模式中可产生不同程度的本底。由于大量正常人血甭较难得到，国外试剂盒中的对照品多以复钙人血浆为原料，即在血浆中加入钙离子，使其中的纤维蛋白质凝固，除去凝块后所得的液体，其组成与血清相似。阴性对照品须先行检测，确定其中不含待测物质。例如HBsAg检测的阴性对照品中不可含HBsAg，最好抗HBs也是阴性。阳性对照品多以含蛋白保护剂的缓冲液为基质，其中加入一定量的待检物质，此量最好在试剂说明书中标明。加入的量应与试剂的敏感度相称，在测定中得到的吸光值与受检标本吸光值比较，可对标本中受检物质的量有一个粗略的估计。国外检测HBsAg的ELISA试剂盒检测敏感度约为0.5ng/ml，阳性对照品中含量约为10ng/ml。在对照品中一般加入抗生素和防腐剂，以利保存。
包被用抗体
包被固相载体的抗体应具有高亲和力和高特异性，可取材于抗血清或含单克隆抗体的腹水或培养液。如免疫用抗原中含有杂质（即便是极微量的），在抗血清中将出现杂抗体，必须除去（可用吸收法）后才能用于ELISA，以保证试验的特异性。抗血清不能直接用于包被，应先提取IgG，通常采用硫酸铵盐析和Sephadex凝胶过滤法。一般经硫酸铵盐析粗提的IgG已可用于包被，高度纯化的IgG性质不稳定。如需用高亲和力的抗体包被以提高试验的敏感性，则可采用亲和层析法以除去抗血清中含量较多的非特异性IgG。腹水中单抗的浓度较高，特异性亦较强，因此不需要作吸收和亲和层析处理，一般可将腹水作适当稀释后直接包被，必要时也可用纯化的IgG。应用单抗包被时应注意，一种单抗仅针对一种抗原决定簇，在某些情况下，用多种单抗混合包被，可取得更好的效果。
包被的条件
包被用抗原或抗体的浓度，包被的温度和时间，包被液的pH等应根据试验的特点和材料的性质而选定。抗体和蛋白质抗原一般采用pH9.6的碳酸盐缓冲液作为稀释液，也有用pH7.2的磷酸盐缓冲液及pH7~8的Tris-HCL缓冲液作为稀释液的。通常在ELISA板孔中加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置过夜，37℃中保温2小时被认为具有同等的包被效果。包被的最适当浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化，每批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定。一般蛋白质的包被浓度为100ng/ml-20ug/ml。
包被的方式
将抗原或抗体固定在过程称为包被。换言之，包被即是抗原或抗体结合到固相载体表面的过程。蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用于。这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。载体对不同蛋白质的吸附能力是不相同的，大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体表面。 IgG对聚苯乙烯等固相具有较强的吸附力，其联结多发生在Fc段上，抗体结合点暴露于外，因此抗体的包被一般均采用直接吸附法。蛋白质抗原大多也可采用与抗体相似的方法包被。当抗原决定簇存在于或邻近于疏水区域时，抗原与固相载体的直接吸附可使抗原决定簇不能充分暴露，在这种情况下，直接包被效果不佳，可以采用间接的捕获包被法，即先将针对该抗原的特异抗体作预包被，其后通过抗原抗体反应使抗原固相化。此间接结合在固相上的抗原远离载体表面，其抗原决定簇也得以充分暴露。间接包被的抗原经固相抗体的亲和层析作用，包被在固相上的抗原纯度大大提高，因此含杂质较多的抗原也可采用捕获包被法，试验的特异性、敏感性均由此得以改善，重复性亦佳。间接包被的另一优点是抗原用量少，仅为直接包被的1/10乃至于/100。不易吸附在聚苯乙烯载体上的非蛋白质抗原可采用特殊的包被方式。例如，在检测抗DNA抗体时，需用DNA作为包被抗原，而普遍的固相载体一般不能直接与核酸结合。可将聚苯乙烯板先经紫外线照射，以增加其吸附性能。固相载体先用碱性蛋白质，如聚赖氨酸、鱼精蛋白等作预包被，也可提高核酸的结合力。也可用亲和素生物素系统作间接包被，即用亲和素先包被载体，然后加入生物素化的DNA，这种包被方法均匀、牢固，已扩大应用于各种抗原物质的定量测定。
脂类物质无法与固相载体结合，可将其在有机溶剂中溶解后加入ELISA板孔中，开盖置冰箱过夜或冷风吹干，待酒精挥发后，让脂质自然干固在固相表面。抗心磷脂抗体的ELISA试剂一般采用这种包被方式。
洗板方法：
1. 手工洗板方法：吸去或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液至少0.3ml注入孔内，浸泡1-2分钟，根据需要，重复此过程数次。
2. 自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。待检样本：体液、血清、血浆、细胞培养上清液、尿液、组织匀浆、心房水标本等
请问Abbkine的蛋白质纯化的填料有具体的信息资料吗？ 123
秋季艳阳一个天2021-07-27
我是第一次做蛋白质纯化实验，希望多多指教！
肿瘤检测pcr试剂盒规格100t什么意思_问答详情_蛋白纯化试剂盒_...123
允儿08932017-10-03
肿瘤检测pcr试剂盒 规格100t 这个规格是按照样本的数量来决定的，样本数量直接决定了你所使用的盒子的规格，这个规格的大小取决于样本数量。
【求助】新手求教coIP抗体纯化的问题!谢谢! 蛋白质和糖学技术...123
clearor2021-07-31
国内ELISA试剂盒哪个品牌好?123
★鲁鲁修★H9d2017-10-03
ELISA试剂盒很多牌子都不错，关键看灵敏度、实验效果、技术支持以及实验经费来决定
动物检疫防疫简答问答名词解释123
1021105087a2021-08-17
医院测抗体一般是用ELISA方法.灵敏度很高的. 在其他地方,还有血凝抑制试验,琼脂扩散试验,抗体蛋白纯化定量,抗体活性检测等. 根据要求不同,选择不同的方法,现在医院最常用.使用方便的就是ELISA试剂盒. 原理是：在反应板上包上抗原,然后加入检测样品液（血清,组织液等,需要处理一下）,如果检测样品中有抗体,就可以与抗原结合,再加入酶标记的抗抗体,就可以和样品中抗体结合,加入显色剂,显色后,检测,通过吸光度的多少,确定抗体的含量.
问个,一抗二抗结合的问题(elisa)123
星辰之守望者2017-10-03
世界著名抗体公司大全介绍 环球风云 123
—千零一个愿望2017-10-03
是美国最早实现亲和素纯化二抗商业化的生物公司，同时也是世界上最大的二抗和底物显色系统的生产商。其可以提供高质量的用于分子生物学、免疫学、细胞生物学和体外诊断试剂，其产品有：亲和纯化的抗体和偶联物、ELISA和杂交底物、蛋白检测和纯化试剂盒、核酸标记和检测试剂以及其它辅助试剂等。
ELISA中包被抗体与一抗有何区别 123
莫甘娜QGm92021-07-24
elisa抗原包被和抗体包被的区别（一）包被用抗原
用于包被固相载体的抗原按其来源不同可分为天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。天然抗原可取自动物组织、微生物培养物等，须经提取纯化才能作包被用。如HBsAg可以从携带者的血清中提取，一般的细菌和病毒抗原可以从其培养物中提取，蛋白成份抗原可从富含此抗原的材料中提取等（例如AFP从脐带血或胎肝中提取）。重组抗原是抗原基因在质粒体中表达的蛋白质抗原，多以大肠杆菌或酵母菌为质粒体。重组抗原的优点是除工程菌成份外，其他杂质少，而且无传染性，但纯化技术难度较大。以大肠杆菌为质粒体的重组抗原如不能充分除大肠杆菌成份，用于ELISA试剂盒，在反应中可出现假阳性，因不少受检者受大肠杆菌感染而在血清中存在抗大肠杆菌抗体。重组抗原的另一特点是能用基因工程制备某些无法从天然材料中分离的抗原物质。例如丙型肝炎病毒（HCV）尚不能培养成功，而且丙肝病人血清中HCV抗原含量极微。目前检测抗HCVELISA中所用包被抗原大多为根据HCV的基因克隆表达而制备的重组抗原。在传染病诊断中，不少重组抗原如HBsAg、HBeAg和HIV抗原等均在ELISA中取得应用。合成多肽抗原是根据蛋白质抗原分子的某一抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。多肽抗原一般只含有一个抗原决定簇，纯度高，特异性也高，但由于分子量太小，往往难于直接吸附于固相上。多肽抗原的包被一般需先使其与无关蛋白质如牛血清白蛋白质（BSA）等偶联，借助于偶联物与固相载体的吸附，间接地结合到固相载体表面。应用多肽抗原的另一注意点为他仅能检测与其相应的抗体。一种蛋白质抗原往往含有多个不同的能引起抗体产生的决定簇，因此在受检血清中的其他抗体就不能与该多肽抗原发生反应。另外，某些微生物发生变异时往往发生抗原结构变化，在这种情况下，用个别多肽抗原进行包被可引起其他抗体的漏检。 （二）ELISA试剂盒包被用抗体 包被固相载体的抗体应具有高亲和力和高特异性，可取材于抗血清或含单克隆抗体的腹水或培养液。如免疫用抗原中含有杂质（即便是极微量的），在抗血清中将出现杂抗体，必须除去（可用吸收法）后才能用于ELISA，以保证试验的特异性。抗血清不能直接用于包被，应先提取IgG，通常采用硫酸铵盐析和Sephadex凝胶过滤法。一般经硫酸铵盐析粗提的IgG已可用于包被，高度纯化的IgG性质不稳定。如需用高亲和力的抗体包被以提高试验的敏感性，则可采用亲和层析法以除去抗血清中含量较多的非特异性IgG。腹水中单抗的浓度较高，特异性亦较强，因此不需要作吸收和亲和层析处理，一般可将腹水作适当稀释后直接包被，必要时也可用纯化的IgG。应用单抗包被时应注意，一种单抗仅针对一种抗原决定簇，在某些情况下，用多种单抗混合包被，可取得更好的效果。
用于包被固相载体的抗原按其来源不同可分为天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。天然抗原可取自动物组织、微生物培养物等，须经提取纯化才能作包被用。如HBsAg可以从携带者的血清中提取，一般的细菌和病毒抗原可以从其培养物中提取，蛋白成份抗原可从富含此抗原的材料中提取等（例如AFP从脐带血或胎肝中提取）。重组抗原是抗原基因在质粒体中表达的蛋白质抗原，多以大肠杆菌或酵母菌为质粒体。重组抗原的优点是除工程菌成份外，其他杂质少，而且无传染性，但纯化技术难度较大。以大肠杆菌为质粒体的重组抗原如不能充分除大肠杆菌成份，用于ELISA试剂盒，在反应中可出现假阳性，因不少受检者受大肠杆菌感染而在血清中存在抗大肠杆菌抗体。重组抗原的另一特点是能用基因工程制备某些无法从天然材料中分离的抗原物质。例如丙型肝炎病毒（HCV）尚不能培养成功，而且丙肝病人血清中HCV抗原含量极微。目前检测抗HCVELISA中所用包被抗原大多为根据HCV的基因克隆表达而制备的重组抗原。在传染病诊断中，不少重组抗原如HBsAg、HBeAg和HIV抗原等均在ELISA中取得应用。合成多肽抗原是根据蛋白质抗原分子的某一抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。多肽抗原一般只含有一个抗原决定簇，纯度高，特异性也高，但由于分子量太小，往往难于直接吸附于固相上。多肽抗原的包被一般需先使其与无关蛋白质如牛血清白蛋白质（BSA）等偶联，借助于偶联物与固相载体的吸附，间接地结合到固相载体表面。应用多肽抗原的另一注意点为他仅能检测与其相应的抗体。一种蛋白质抗原往往含有多个不同的能引起抗体产生的决定簇，因此在受检血清中的其他抗体就不能与该多肽抗原发生反应。另外，某些微生物发生变异时往往发生抗原结构变化，在这种情况下，用个别多肽抗原进行包被可引起其他抗体的漏检。 （二）ELISA试剂盒包被用抗体 包被固相载体的抗体应具有高亲和力和高特异性，可取材于抗血清或含单克隆抗体的腹水或培养液。如免疫用抗原中含有杂质（即便是极微量的），在抗血清中将出现杂抗体，必须除去（可用吸收法）后才能用于ELISA，以保证试验的特异性。抗血清不能直接用于包被，应先提取IgG，通常采用硫酸铵盐析和Sephadex凝胶过滤法。一般经硫酸铵盐析粗提的IgG已可用于包被，高度纯化的IgG性质不稳定。如需用高亲和力的抗体包被以提高试验的敏感性，则可采用亲和层析法以除去抗血清中含量较多的非特异性IgG。腹水中单抗的浓度较高，特异性亦较强，因此不需要作吸收和亲和层析处理，一般可将腹水作适当稀释后直接包被，必要时也可用纯化的IgG。应用单抗包被时应注意，一种单抗仅针对一种抗原决定簇，在某些情况下，用多种单抗混合包被，可取得更好的效果。
求助:IgM纯化问题 蛋白质和糖学技术讨论版论坛123
你大爷FaKv2021-07-21
IgM代表的是近期感染病毒或者病原体的一个指标，表明在两周左右的时间内感染了病原体，所以检测IgM可以准确判断是否是新发感染病原体。2、开发何种形式的诊断用试剂盒，你说的方法都是ELISA方法，该方法中包括了检测抗体或者检测抗原等技术方法。具体如何来决定，还看你想从哪方面是想检测抗原还是想检测抗体，还有就是技术路线是否可行，包括单抗制备，抗原表达及纯化等等，可能也应该考虑成本等因素，只有综合考虑上述因素，才能确定用那种方法来研制诊断用试剂盒。
补充一点的是有些病毒在人群中的感染是很普遍的,比如HCMV.对于这些病毒IgM的检测结果可以推测是否为近期感染.但这一类病毒其检测的临床意义经常是当其再激活感染时.比如:HCMV感染后就在末梢单个核细胞中潜伏起来,对于正常人而言是不致病的,但当出现HIV感染或应用免疫抑制剂时会出现激活感染而且经常导致严重疾患.对于这种再激活感染虽然也有IgM的升高,但是却在现在ELISA技术的检测限以下,因此是检测不到的,这时就必须进行针对其抗原的检测。
补充一点的是有些病毒在人群中的感染是很普遍的,比如HCMV.对于这些病毒IgM的检测结果可以推测是否为近期感染.但这一类病毒其检测的临床意义经常是当其再激活感染时.比如:HCMV感染后就在末梢单个核细胞中潜伏起来,对于正常人而言是不致病的,但当出现HIV感染或应用免疫抑制剂时会出现激活感染而且经常导致严重疾患.对于这种再激活感染虽然也有IgM的升高,但是却在现在ELISA技术的检测限以下,因此是检测不到的,这时就必须进行针对其抗原的检测。
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