Volume: Purified: 100 µL; Purified Trial: 20 µL; TC Supernatant: 5 mL
Concentration: Purified: 1 mg/mL; TC Supernatant: Lot Specific
Clonality: Monoclonal
Form: Purified and TC Supernatant Available (select your preferred form, size and quantity before clicking "Add to Cart")
Host Species: Mouse
Immunogen: Synthetic peptide amino acids 411-422 (KTVEMRDGEVIK) of human GFAP (also known as Glial fibrillary acidic protein, accession number P14136)Rat: 100% identity (12/12 amino acids identical)Mouse: 100% identity (12/12 amino acids identical)>50% identity with other proteins (Vimentin, Desmin, Tumor protein p73 and Peripherin)
Target Description: Glial fibrillary acidic protein (GFAP) is an intermediate filament with many different isoforms, and acts as a structural protein in the cytoskeleton. It is expressed in astrocytes in brain and is often used as an astrocyte marker. GFAP is belived to be involved in many CNS processes including cell communication and mitosis. GFAP has been found to be involved in Alexander disease and Wernicke"s encephalopathy.
Gene ID: GFAP
Antibody Registry ID (RRID): AB_10672299
Physical State: Liquid
Validation and Application Notes
Molecular Weight: 50 kDa
NOTE
Aves Labs products are intended for use as research laboratory reagents. They are not intended for use as diagnostic or therapeutic reagents in humans.
↑ back to top
AvesLabs是一家成立于上世纪九十年代,专注于高亲和性鸡源抗体的研发和准备,生物医药和生命科学行业全球*的鸡多克隆抗体(IgY)及定制抗体/多肽/免疫试剂的专业公司。AvesLabs在鸡源神经系统标志蛋白/抗体研究领域拥有独特优势,不仅品种多样,质量优良,而且适用于人/大小鼠等多个物种的神经系统研究,包括神经元/胶质细胞/雪旺细胞的各亚细胞结构免疫双标/免疫共沉淀研究。公司独有的技术及优质抗体产品有助于全球科研人员更为便捷的解决学术研究及应用研发课题。除了丰富的产品线外,AvesLabs还为客户提供优质的抗体定制服务,您只需要提供需要研究的重组蛋白或合成多肽,我们即可为您生产优质的鸡源多克隆抗体。
神经元标志蛋白抗体该系列产品主要用于神经元细胞的各亚细胞结构研究,可与现有的小鼠/兔抗体进行免疫双标,反应性包括人、小鼠等多个哺乳类动物。在保证抗体特异性的前提下,部分产品可分为抗不同的氨基酸片段。该系列产品包括抗APP3/APP345/APP4/APP5/ABN/TUJ/CAT/DCX/ER1/ER2/ER3/ER5/GAD/GAP43/MAP/NET/NUN/NSE/NFH/NFL/NFM/PER/PRN/PAP/STG/TAU/TYH的抗体。除单独的抗体提供,我们还可同时提供1/3种任意抗体组合及相应二抗的试剂盒,以更优惠的价格及便捷性以满足研究人员的不同需要。
胶质细胞及雪旺细胞标志蛋白抗体该系列产品主要用于胶质细胞及雪旺细胞的各亚细胞结构的研究,可与可与现有的小鼠/兔抗体进行免疫双标,反应性包括人、大鼠等多个哺乳类动物。在保证抗体特异性的前提下,部分产品可分为抗不同的氨基酸片段。该系列产品包括抗COR/GFAP/MAC/MBP/NES/PZO/PLP/VIM抗体。同样,除单独的抗体提供,我们还可同时提供1/3种任意抗体组合及相应二抗的试剂盒,以更优惠的价格及便捷性以满足研究人员的不同需要。
二抗该系列产品特点在于鸡IgY分子与哺乳动物IgG分子截然不同,因此由之制备的二抗不与来源于兔、小鼠或其他哺乳动物的一抗产生交叉反应,特别适用于组织学的免疫双标检测。该系列源于羊的二抗可交联荧光基团/HRP/生物素/琼脂糖,可广泛用于WB,免疫组化/免疫细胞化学及免疫共沉淀研究。
mmunoprecipitationReagents(IP)该系列产品中 HA-PrecipHen® 由鸡anti-HAepitopetag抗体共价结合到琼脂糖粒而成,适用于利用HAepitope-tagged蛋白的immunoprecipitation(IP),chromatinimmunoprecipitation(ChIP)以及蛋白纯化研究。而IgY-PrecipHen®由羊抗鸡的IgY抗体共价结合到琼脂糖粒上而成,适用于鸡源抗体与目标蛋白之间的immunoprecipitation(IP),chromatinimmunoprecipitation(ChIP)以及蛋白纯化研究。
对高度保守的哺乳动物基因产物有更高的描述由于鸡与哺乳动物的距离至少有1亿年之久,它们倾向于将哺乳动物的任何基因产物视为外来物,并产生强烈的免疫反应。简单双疣状鸡IgYs可以与小鼠和兔抗体一起使用,没有交叉反应的危险。针对鸡igy的二级抗体不会与哺乳动物igg发生交叉反应。友好型我们从鸡蛋中纯化抗体,而不是血清。与此相反,在兔实验中,通过抑制动物,进行耳出血或心脏穿刺来获得血清。这只是一种更人道的产生抗体的方法。成本效益和更持久的我们的鸡用抗体是>90%IgY,在4度完美呈现5年以上保质期。相比之下,多数公司提供的rabbitserum(兔乳)在4˚C (完美呈现)(以周至月为单位)的货架期非常有限,而且一旦冷冻,一些生物活性会丧失。将兔抗体纯化至相应纯度的成本。蛋白质a纯化)是非常昂贵的。几乎无限量我们从每只母鸡那里收集了大约18个“免疫鸡蛋”,但是只使用了6个“免疫鸡蛋”来准备你的IgY准备。然后我们把剩下的12个“免疫鸡蛋”储存在冰箱里,以备将来你需要更多的抗体。此外,我们可以继续为母鸡提供住宿(另收费),以备您需要我们进行额外的注射。鸡IgY的茎部没有“Fc结构域”这提供了几个优势比兔igg:它减少了在诊断应用中出现假阳性的可能性,因为是哺乳动物的Fc域结合“类风湿因子”或其他自然产生的抗Fc抗体。不激活哺乳动物补体系统,允许鸡IgYs在体内应用。不与哺乳动物Fc受体结合,避免与表达此类受体的细胞(如巨噬细胞和树突状细胞)发生非特异性结合。
ebiomall.com
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
(一)包被用抗原
用于包被固相载体的抗原按其来源不同可分为天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。天然抗原可取自动物组织、微生物培养物等,须经提取纯化才能作包被用。如HBsAg可以从携带者的血清中提取,一般的细菌和病毒抗原可以从其培养物中提取,蛋白成份抗原可从富含此抗原的材料中提取等(例如AFP从脐带血或胎肝中提取)。重组抗原是抗原基因在质粒体中表达的蛋白质抗原,多以大肠杆菌或酵母菌为质粒体。重组抗原的优点是除工程菌成份外,其他杂质少,而且无传染性,但纯化技术难度较大。以大肠杆菌为质粒体的重组抗原如不能充分除大肠杆菌成份,用于ELISA试剂盒,在反应中可出现假阳性,因不少受检者受大肠杆菌感染而在血清中存在抗大肠杆菌抗体。重组抗原的另一特点是能用基因工程制备某些无法从天然材料中分离的抗原物质。例如丙型肝炎病毒(HCV)尚不能培养成功,而且丙肝病人血清中HCV抗原含量极微。目前检测抗HCVELISA中所用包被抗原大多为根据HCV的基因克隆表达而制备的重组抗原。在传染病诊断中,不少重组抗原如HBsAg、HBeAg和HIV抗原等均在ELISA中取得应用。合成多肽抗原是根据蛋白质抗原分子的某一抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。多肽抗原一般只含有一个抗原决定簇,纯度高,特异性也高,但由于分子量太小,往往难于直接吸附于固相上。多肽抗原的包被一般需先使其与无关蛋白质如牛血清白蛋白质(BSA)等偶联,借助于偶联物与固相载体的吸附,间接地结合到固相载体表面。应用多肽抗原的另一注意点为他仅能检测与其相应的抗体。一种蛋白质抗原往往含有多个不同的能引起抗体产生的决定簇,因此在受检血清中的其他抗体就不能与该多肽抗原发生反应。另外,某些微生物发生变异时往往发生抗原结构变化,在这种情况下,用个别多肽抗原进行包被可引起其他抗体的漏检。
(二)ELISA试剂盒包被用抗体
包被固相载体的抗体应具有高亲和力和高特异性,可取材于抗血清或含单克隆抗体的腹水或培养液。如免疫用抗原中含有杂质(即便是极微量的),在抗血清中将出现杂抗体,必须除去(可用吸收法)后才能用于ELISA,以保证试验的特异性。抗血清不能直接用于包被,应先提取IgG,通常采用硫酸铵盐析和Sephadex凝胶过滤法。一般经硫酸铵盐析粗提的IgG已可用于包被,高度纯化的IgG性质不稳定。如需用高亲和力的抗体包被以提高试验的敏感性,则可采用亲和层析法以除去抗血清中含量较多的非特异性IgG。腹水中单抗的浓度较高,特异性亦较强,因此不需要作吸收和亲和层析处理,一般可将腹水作适当稀释后直接包被,必要时也可用纯化的IgG。应用单抗包被时应注意,一种单抗仅针对一种抗原决定簇,在某些情况下,用多种单抗混合包被,可取得更好的效果。展开
液体的一抗加50%甘油,-20度也不会冻结,可保存3-5年;
经常使用时取出一小份,4度可使用半年之久;
粉末状的二抗直接-20或-80度贮藏就行了。
C、如果检测的指标数目超过了流式细胞仪的通道,怎么办?如果需要做5个指标,而流式细胞仪只能做4个通道,首先将指标归成2类,再将样本分成2份,分别检测。比如需要同时检测CD3、CD4、CD8、IL-4和IFN-gamma,那么将样本分成两份,第1份加CD3、CD4、CD8和IL-4,而第2份加CD3、CD4、CD8和IFN-gamma。
二、同型对照(IsotypyControl)1、为什么要用同型对照?同型对照是使用与一抗相同种属来源、相同亚型、相同剂量和相同的免疫球蛋白及亚型的免疫球蛋白,用于消除由于抗体非特异性与细胞结合而产生的背景染色。同型对照是真正意思上的阴性对照,它不但可以用来设定流式细胞仪的电压,而且还可以帮忙省去昂贵与繁琐的重组细胞因子竞争封闭步骤。在流式细胞仪上样前,染色方式如下:样本管:一抗+样本同型对照管:同型对照+样本
2、如何选择同型对照?一般选择与一抗的成分完全相同种属来源、相同亚型和亚链、相同荧光标记的抗体,比如抗人的CD56APC标记的抗体,货号是555518,成份是MouseIgG1,κ。那么它的同型对照应该是APC标记的MouseIgG1,κ,货号是555751。注意同型对照的成份跟它的名称是相同的.如果是抗体的组合形式是纯化的一抗+荧光标记的二抗,那么应该选择一抗的同型对照。比如CDw125的纯化抗体,货号是555901,成分是MouseIgG1,κ。它的同型对照是纯化的MouseIgG1,κ,货号是555746。它的二抗PE标记的抗小鼠IgG1,货号是550083。那么染色方式如下:样本管:纯化的CDw25+PE标记的抗MouseIgG1+样本同型对照管:纯化的同型对照+PE标记的抗MouseIgG1+样本
如果没有找到适合的同型对照,在保持来源相同、荧光标记相同、免疫球蛋白类别相同条件下,那么优先选择的顺序应该是亚链不同--亚型不同--相同类别。比如,某种的抗体的来源是MouseIgG2а,κ。如果在同型对照表里面找到不到完全相同的同型对照,那么优先选择相同荧光标记的MouseIgG2а为同型对照。如果也没有找到MouseIgG2а,那么优先选择相同荧光标记的MouseIgG2b作为同型对照。如果最后还是没有找到MouseIgG2b,那么选者相同荧光标记的MouseIgG2作为同型对照。
3、如何查找同型对照?同型对照在BD英文目录中或者BD网站上跟它对照的抗体的位置是一致的。BD目录中,抗人的抗体的同型对照都在HUMAN章节后面。抗小鼠的抗体的同型对照在MOUSE章节后面,非人类灵长类的抗体同型对照在NONHUMANPRIMATE章节后面。由于抗大鼠的抗体非常少,大部分抗体都是小鼠来源的,所以它的同型对照跟小鼠的一样,放在MOUSE章节后面。胞内细胞因子、趋化因子、补体、炎症介质及其受体的同型对照放在其章节的后面(注意:人的胞内细胞因子的同型对照跟人的表面标志的同型对照是不在一起的)。Phosflow的同型对照在Phosflow的介绍后面。比如,比如抗人的CD56APC标记的抗体,货号是555518,在06版BD目录的169页,成份是MouseIgG1,κ。那么它的同型对照应该是在HUMAN章节中MouseImmunoglobulinIsotype表格中,第191页,APC标记的MouseIgG1,κ,货号是555751。
4、哪些客户需要使用同型对照?A对流式不是非常熟悉的客户。B做胞内流式客户,比如胞内细胞因子、趋化因子和信号蛋白等。C使用不常见的标志或者特异性不高的标志的客户,因为客户不熟悉不常见标志的表达情况,根据同型对照可以判断阳性细胞的位置。一些特异性不高的抗体,如多抗,非特异性结合非常多,使用同型对照可排除假阳性。D对流式非常熟悉又使用常用的表面标志的客户一般可以不使用同型对照。
5、为什么有时候同型对照的表达会比抗体的表达高?首先需要检查同型对照的抗体是否加错类型、剂量等。其次,因为有些标志在细胞的表面或者胞内表达不高,而跟其类似的抗原非常多,那么加入同型对照时,同型对照非特异性的结合会超过抗体的特异性,所以会造成这种现象,在细胞表面时如图所示。这个时候推荐使用其他阴性对照,如空白对照等。
三、补偿微球流式细胞仪的荧光补偿隔一段时间之后需要调整到适合的位置。如果荧光补偿没有调节好,会导致细胞分群不明显或者流式检测得到的结果图非常不漂亮,而且会影响到检测结果的不真实。荧光补偿的调节对初学者来说非常不容易掌握,同时,补偿调节是流式细胞术中比较难掌握的操作。尤其是一些不常见的标志检测时,需要经验非常丰富的流式操作者根据多年的经验判断调节补偿,才可以得到比较好的数据和图片。那么,现在不需要这么麻烦。因为补偿微球让一切变得更简单。BDCompBeads是专用于流式细胞仪多色分析的荧光补偿调整微球。它的实用性是在于克服了以往普通的做三色以上的流式分析时补偿难调、耗费样本(往往用待测样本单标来进行补偿调节)的缺点。它本身不携带任何荧光,借助于与客户自己的特异性荧光抗体孵育结合来调节补偿。它不但能象待测的样本细胞一样在同样的实验条件下固定、破膜等,操作起来很简单,灵敏度高,一致性好,使补偿更轻松更准确,而且最难得的是它最适合于多色分析(如五色、六色、七色等)和复合荧光素(如PE-Cy7、APC-Cy7等),因为这时的补偿往往难度较大。各型号的流式仪器均能使用。Compbeads使用后可以将流式的条件保存,方便下次做同样的荧光染色搭配时参考用。
想通过亲和层析来纯化抗血小板特异性抗体(抗GPIIb/IIIa抗体和抗GPIbα抗体),能否做到呢?谢谢!
双抗无论是在免疫学还是细胞操作,细胞培养中都不与二抗等同。双抗可以是抗一种抗原的两个抗体,去双抗夹心法。也可以是抗不同类型反应的作用物,如抗凝剂素。一般指两种抗生素。
规格:96T 48T
用途:科研实验(仅供实验室研究使用)
保存:2-8℃。
有效期:6个月
结合物的制备
1. 戊二醛交联法
戊二醛是一种双功能团试剂,它可以使酶与蛋白质的氨基通过它而联结。碱性磷酸一般用此法进行标记。交联方法一步法、两步法两种。在一步法中戊二醛直接加入酶与抗体的混合物中,反应后即得酶标记抗体。
ELISA中常用的酶一般都用此法交联。它具有操作简便、有效和重复性好等优点。缺点是交联反应是随机的,酶与抗体交联时分子间的比例不严格,结合物的大小也不均一,酶与酶,抗体与抗体之间也有可能交联,影响效果。在两步法中,先将酶与戊二醛作用,透析除去多余的戊二醛后,再与抗体作用而形成酶标抗体。也可先将抗体与戊二醛作用,再与酶联结。两步法的产物中绝大部分的酶与蛋白质是以1:1的比例结合的,较一步法的酶结合物更有助于本底的改善以提高敏感度,但其偶联的有效率较一步法低。
2. 过碘酸盐氧化法:本法只适用于含糖量较高的酶。辣根过氧化物酶的标记常用此法。反应时,过碘酸钠将HRP分子表面的多糖氧化为醛基很活泼,可与蛋白质上的氨基形成Schiff氏碱而结合。酶标记物按克分子比例联结,其最佳比例为:酶/抗体=1-2/1。此法简便有效,一般认为是HRP最可取的标记方法,但也有人认为所有试剂较为强烈,各批实验结果不易重演。
按以上方法制备的酶结合物一般都混有未结合物的酶和抗体。理论上,结合物中混有的游离酶一般不影响ELISA中最后的酶活性测定,因经过彻底洗涤,游离酶可被除去,并不影响最终的显色。但游离的抗体则不同,它会与酶标抗体竞争相应的固相抗原,从而减少了结合到固相上的酶标抗体的量。因此制备的酶结合物应予纯化,去除游离的酶和抗体后用于检测,效果更好。纯化的方法很多,分离大分子化合物的方法均可应用。硫酸铵盐析法最为简便,但效果并不理想,因为此法只能去除留在上清中的游离酶,但相当数量的游离抗体仍与酶结合物一起沉淀而不能分开。用离子交换层析或分子筛分离更为可取,高效液相层析法可将制备的结合物清晰地分成三个部分:游离酶、游离抗体和纯结合物而取得最佳的分离效果,但费用较贵。
结合物制得后,在用作ELISA试剂前尚需确定其适当的工作浓度。使用过浓的结合物,既不经济,又可使本底增高;结合物的浓度过低,则又影响检测的敏感性。所以必须对结合物的浓度予以选择。最适的工作浓度就是指结合物稀释至这一浓度时,能维护一个低的本底,并获得测定的最佳灵敏度,达到最合适的测定条件和测定费用的节省。就酶标抗体本身而言,它的有效工作浓度是指与其相应抗原包被的载体作试验时,能得到阳性反应的最高稀释度。例如某一HRP:抗人IgG制剂标明的工作浓度为1:5000,表示该制剂经1:5000稀释后,在与人IgG包被的固相作ELISA试验时,将发生阳性反应。但在用于具体的ELISA检测中,酶标抗体的最适工作浓度受到固相载体的性质、包被抗原或抗体的纯度以及整个检测系统如标本、反应温度和时间等的影响,因此必须在实际测定条件下进行"滴配"选择能达到高敏感度的最大稀释度作为试剂盒中的工作浓度。
结合物的保存
酶标抗体中的酶和抗体均为生物活性物质,保存不当,极易失活。高浓度的结合物较为稳定,冰冻干燥后可在普通冰箱中保存一年左右,但冻干过程中引起活力的减低,而且使用时需经复溶,颇为不便。结合物溶液中加入等体积的甘油可在低温冰箱或普通冰箱的冰格中较长时间保存。早期的ELISA试剂盒中的结合物一般均按以上两种形式供应,配以稀释液(见3.2.5)临用时按标明的稀释度稀释成工作液。现在较先进的ELISA试剂盒均已用合适的缓冲液配成工作液,使用时不需再行稀释,在4-8℃保存期可达6个月。由于蛋白质浓度较低,结合物易失活,需加入蛋白保护剂。另外再加入抗生素(例如庆大霉素)和防腐剂(HRP结合物加硫柳泵,AP结合物可加叠氮钠),以防止细菌生长。
结合物的稀释液
用于稀释高浓度的结合物以配成工作液。为避免结合物在反应中直接吸附在固相载体上,在稀释缓冲液中常加入高浓度的无关蛋白质(例如1%牛血清白蛋白),通过竞争以抑制结合物的吸附。一般还加入具有抑制蛋白质吸附于塑料表面的非离子型表面活性剂,如吐温20,0.05%的浓度较为适宜。在间接测定抗体时,血清标本需稀释后进行测定,也可应用这种稀释液。
试剂盒组成
标本要求
1. 标本采集后尽早进行提取,提取按相关文献进行,提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验,可将标本放于-20℃保存,但应避免反复冻融
2. 不能检测含NaN3的样品,因NaN3抑制辣根过氧化物酶的(HRP)活性。
操作步骤
1. 标准品的稀释:本试剂盒提供原倍标准品一支,用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。
2. 加样
分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂,其余各步操作相同)、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl,待测样品孔中先加样品稀释液40μl,然后再加待测样品10μl(样品最终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀。
3. 温育:用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
4. 配液:将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用
5. 洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30秒后弃去,如此重复5次,拍干。
6. 加酶:每孔加入酶标试剂50μl,空白孔除外。
7. 温育:操作同3。
8. 洗涤:操作同5。
9. 显色:每孔先加入显色剂A50μl,再加入显色剂B50μl,轻轻震荡混匀,37℃避光显色15分钟.
10. 终止:每孔加终止液50μl,终止反应(此时蓝色立转黄色)。
11. 测定:以空白空调零,450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。
操作程序总结:
计算
以标准物的浓度为横坐标,OD值为纵坐标,在坐标纸上绘出标准曲线,根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度;再乘以稀释倍数;或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式,将样品的OD值代入方程式,计算出样品浓度,再乘以稀释倍数,即为样品的实际浓度。
注意事项
1. 试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用,酶标包被板开封后如未用完,板条应装入密封袋中保存。
2. 浓洗涤液可能会有结晶析出,稀释时可在水浴中加温助溶,洗涤时不影响结果。
3. 各步加样均应使用加样器,并经常校对其准确性,以避免试验误差。一次加样时间最好控制在5分钟内,如标本数量多,推荐使用排枪加样。
4. 请每次测定的同时做标准曲线,最好做复孔。如标本中待测物质含量过高(样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值),请先用样品稀释液稀释一定倍数(n倍)后再测定,计算时请最后乘以总稀释倍数(×n×5)。
5. 封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染。
6. 底物请避光保存。
7. 严格按照说明书的操作进行,试验结果判定必须以酶标仪读数为准.
8. 所有样品,洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。
9. 本试剂不同批号组分不得混用。
洗涤液
在板式ELISA中,常用的稀释液为含0.05%吐温20磷酸缓冲盐水。
酶反应终止液
常用的HRP反应终止液为硫酸,其浓度按加量及比色液的最终体积而异,在板式ELISA中一般采用2mol/L。
阳性对照品和阴性对照品
阳性对照品和阴性对照品是检验试验有效性的控制品,同时也作为判断结果的对照,因此对照品,特别是阳性对照品的基本组成应尽量与检测标本的组成相一致。以人血清为标本的测定,对照品最好也为人血清,因为正常人血清在各种ELISA模式中可产生不同程度的本底。由于大量正常人血甭较难得到,国外试剂盒中的对照品多以复钙人血浆为原料,即在血浆中加入钙离子,使其中的纤维蛋白质凝固,除去凝块后所得的液体,其组成与血清相似。阴性对照品须先行检测,确定其中不含待测物质。例如HBsAg检测的阴性对照品中不可含HBsAg,最好抗HBs也是阴性。阳性对照品多以含蛋白保护剂的缓冲液为基质,其中加入一定量的待检物质,此量最好在试剂说明书中标明。加入的量应与试剂的敏感度相称,在测定中得到的吸光值与受检标本吸光值比较,可对标本中受检物质的量有一个粗略的估计。国外检测HBsAg的ELISA试剂盒检测敏感度约为0.5ng/ml,阳性对照品中含量约为10ng/ml。在对照品中一般加入抗生素和防腐剂,以利保存。
包被用抗体
包被固相载体的抗体应具有高亲和力和高特异性,可取材于抗血清或含单克隆抗体的腹水或培养液。如免疫用抗原中含有杂质(即便是极微量的),在抗血清中将出现杂抗体,必须除去(可用吸收法)后才能用于ELISA,以保证试验的特异性。抗血清不能直接用于包被,应先提取IgG,通常采用硫酸铵盐析和Sephadex凝胶过滤法。一般经硫酸铵盐析粗提的IgG已可用于包被,高度纯化的IgG性质不稳定。如需用高亲和力的抗体包被以提高试验的敏感性,则可采用亲和层析法以除去抗血清中含量较多的非特异性IgG。腹水中单抗的浓度较高,特异性亦较强,因此不需要作吸收和亲和层析处理,一般可将腹水作适当稀释后直接包被,必要时也可用纯化的IgG。应用单抗包被时应注意,一种单抗仅针对一种抗原决定簇,在某些情况下,用多种单抗混合包被,可取得更好的效果。
包被的条件
包被用抗原或抗体的浓度,包被的温度和时间,包被液的pH等应根据试验的特点和材料的性质而选定。抗体和蛋白质抗原一般采用pH9.6的碳酸盐缓冲液作为稀释液,也有用pH7.2的磷酸盐缓冲液及pH7~8的Tris-HCL缓冲液作为稀释液的。通常在ELISA板孔中加入包被液后,在4-8℃冰箱中放置过夜,37℃中保温2小时被认为具有同等的包被效果。包被的最适当浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化,每批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定。一般蛋白质的包被浓度为100ng/ml-20ug/ml。
包被的方式
将抗原或抗体固定在过程称为包被。换言之,包被即是抗原或抗体结合到固相载体表面的过程。蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的,靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用于。这种物理吸附是非特异性的,受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。载体对不同蛋白质的吸附能力是不相同的,大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团,故更易吸附到固相载体表面。 IgG对聚苯乙烯等固相具有较强的吸附力,其联结多发生在Fc段上,抗体结合点暴露于外,因此抗体的包被一般均采用直接吸附法。蛋白质抗原大多也可采用与抗体相似的方法包被。当抗原决定簇存在于或邻近于疏水区域时,抗原与固相载体的直接吸附可使抗原决定簇不能充分暴露,在这种情况下,直接包被效果不佳,可以采用间接的捕获包被法,即先将针对该抗原的特异抗体作预包被,其后通过抗原抗体反应使抗原固相化。此间接结合在固相上的抗原远离载体表面,其抗原决定簇也得以充分暴露。间接包被的抗原经固相抗体的亲和层析作用,包被在固相上的抗原纯度大大提高,因此含杂质较多的抗原也可采用捕获包被法,试验的特异性、敏感性均由此得以改善,重复性亦佳。间接包被的另一优点是抗原用量少,仅为直接包被的1/10乃至于/100。不易吸附在聚苯乙烯载体上的非蛋白质抗原可采用特殊的包被方式。例如,在检测抗DNA抗体时,需用DNA作为包被抗原,而普遍的固相载体一般不能直接与核酸结合。可将聚苯乙烯板先经紫外线照射,以增加其吸附性能。固相载体先用碱性蛋白质,如聚赖氨酸、鱼精蛋白等作预包被,也可提高核酸的结合力。也可用亲和素生物素系统作间接包被,即用亲和素先包被载体,然后加入生物素化的DNA,这种包被方法均匀、牢固,已扩大应用于各种抗原物质的定量测定。
脂类物质无法与固相载体结合,可将其在有机溶剂中溶解后加入ELISA板孔中,开盖置冰箱过夜或冷风吹干,待酒精挥发后,让脂质自然干固在固相表面。抗心磷脂抗体的ELISA试剂一般采用这种包被方式。
洗板方法:
1. 手工洗板方法:吸去或甩掉酶标板内的液体;在实验台上铺垫几层吸水纸,酶标板朝下用力拍几次;将推荐的洗涤缓冲液至少0.3ml注入孔内,浸泡1-2分钟,根据需要,重复此过程数次。
2. 自动洗板:如果有自动洗板机,应在熟练使用后再用到正式实验过程中。待检样本:体液、血清、血浆、细胞培养上清液、尿液、组织匀浆、心房水标本等