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| 实验材料 | 冷冻肌肉 试剂、试剂盒 | 肌球蛋白抽提溶液 仪器、耗材 | 玻璃器皿 实验步骤 | 1.准备下面的贮存液（都冷却到4℃）。 肌球蛋白抽提溶液：0.5mol/LKCl，0.1mol/LK2HPO4 几升冷的用玻璃器皿蒸馏过的水（dH2O） 4mol/LKCl 0.5mol/LKCI 0.5mol/LCH3COOH 0.5moI/LK+EDTA，pH7.0 1mol/LNaHCO3 用10mmol/LK+EDTA饱和（NH4）2SO4 1LdH2O中加780gSchwartz-Mann的超纯（NH4）2SO4，然后边加热边搅拌直到溶解。 估计一下体积，加入0.5mol/LK+EDTA使终浓度为10mmol/L。用NH4Cl调pH使表观值为8.2。少量样品用dH2O以1:10稀释，pH值应该为7.0左右。 破坏肌肉细胞 2.可接受的方法处死鸡或兔或者使用Pel-Freez的冷冻肌肉（冷冻材料在通过绞肉机前先融化一部分）。 3.快速剥掉鸡或兔的皮，然后从你希望回收肌动蛋白和肌球蛋白的部位解剖下来300克合适的肌肉，然后把它们放在冰上。 4.冷的肌肉用一个事先经过冰冷的10mmol/LK+EDTA，pH7.0浸泡至4℃的绞肉机绞两次并称重。 抽提肌动蛋白和肌球蛋白 5.3倍体积的肌球蛋白抽提溶液（w/v）在冰库搅拌抽提，正好10分钟。 6.混和物分到6个150ml离心瓶中，用GSA转头以最髙速（13000r/min，17310g）离心15分钟使不溶的肌肉残渣沉淀下来。 分离肌球蛋白 7.转移上清，测量上清的体积，用0.5mol/L乙酸调pH到6.6。 8.在轻轻搅拌的同时，慢慢地用10倍体积冷的dH2O稀释来沉淀肌球蛋白以及一些抽提到的肌动蛋白。再次检査pH值，如果需要就调节pH到6.6。 9.用大容量离心机，例如带0.5L瓶的GS3型，以最高速（9000r/min，8622g）离心20分钟离下沉淀物。弃掉清亮的上清，留下白色致密的沉淀物。 肌球蛋白的酸沉淀 10.在50mI2mol/LKCl中溶解沉淀物。用一个带松的研杵的Dounce牌匀浆器（一种用玻璃研杵的玻璃匀浆器）以保证彻底破坏沉淀块。 11.测量溶液总体积并假设沉淀物的KCI浓度为45mmol/L来计算KCl的浓度。用4mol/LKCl调节KCl浓度到0.5mol/L，然后加足量的0.5mol/LKCl来降低黏滞度使足以进行下面的操作。溶液转移到带刻度的1L塑料烧杯中。 12.检査溶液的pH值，如果必要就用NaHCO3调pH值至6.7~6.8。 13.不停地搅拌，缓慢加入冷的蒸馏水来降低KCl的浓度直至0.4mol/L。 14.离心（高速SS-34型，20000r/min，32180g；或者GSA型，13000r/min，17130g）10分钟，把所有沉淀物都离心下来。保留上清。 15.加冷的dH2O以进一步降低KCl的浓度至0.3mol/L。如前进行沉淀；保留上清和沉淀物。 16.测量上清的体积并在不停搅拌的情况下用冷的蒸馏水小心地稀释直至KCl浓度为0.04mol/L。 17.离心沉淀肌球蛋白粗丝（高速SS-34型或GSA型离心10分钟）并弃掉上清。 18.估计沉淀物的体积，然后加足够的4mol/LKCl来提高KCl的浓度到0.5mol/L，然后用0.5mol/LKCl稀释样品到450ml。 用（NH4）2SO4沉淀肌球蛋白 19.缓慢加入饱和的（NH4）2SO4（向下）使（NH4）2SO4饱和度为40%，不停搅拌使充分混合。 20.离心沉淀（高速GSA型17310g离心15分钟），保留沉淀作为“40%（NH4）2SO4时的样品”。 21.不停搅拌的情况下在上清中加入足够体积的饱和（NH4）2SO4使其饱和度为50%，加入的（NH4）2SO4体积会是肌球蛋白溶液体积的1/5。搅拌15分钟。 22.离心沉淀（见步骤20)并弃掉上清。标记上“50%（NH4）2SO4时的样品”。 23.为了使蛋白浓度保持最大，在最小体积的0.5mol/LKCl中重悬40%和50%的（NH4）2SO4沉淀物（用刮刀直接把固态的（NH4）2SO4沉淀放进透析袋）。 24.在1L0.5mol/LKCl，10mmol/L咪唑-HCl，pH7.0，10mmol/LK+EDTA，pH7.0中对（NH4）2SO4沉淀的样品进行透析，在24小时内至少换2次透析液。 25.20000r/min（31180g）离心30分钟使溶液变清。这些肌球蛋白在KCl-EDTA中可以稳定数周。为了保存更长时间，它可以和甘油以1:1混合并贮存在-20℃。此外，可以让肌球蛋白留在（NH4）2SO4中，盖要的时候透析一小部分。 26.测定肌球蛋白制品的蛋白浓度，ATP酶活性，通过SDS-PAGE测定纯度，和/或通过体外移动试验测定其功能。 |
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发布于 ： 2021-09-14
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