| 实验步骤 | 免疫印迹 当知道蛋白质相对分子质量的大小，免疫印迹方法可从任何数量的蛋白质混合物中检测出目的蛋白。不过，这种方法要依赖使用针对目的蛋白的一种高质量的抗体。这是用SDS-PAGE方法对蛋白质按相对分子质量大小进行分离和直接酶免疫检测方法结合在一起检测方法。这种方法不仅能确定目的蛋白是否存在，也能确定其相对分子质量大小。 一、试刻转移缓冲液：25mmol/LTris，192mmol/L甘氨酸，20%的甲醇，PH7.8〜8.2 洗涤缓冲液：150mmol/LPBS，0.05%Tween 封闭缓冲液：150mmol/LPBS，l.0%脱脂奶粉 特异性结合目标配体的一抗 特异性结合一抗并与辣根过氧化物酶（HRP)交联的二抗 TMB膜过氧化物酶底物 二、仪器和其他耗材免疫印迹装置 冷却装置 滤纸 吸水海绵垫 转移缓冲液 三、操作步骤(1)按照前面叙述的进行SDS-PAGE电泳。将包括目标分子的还原和非还原样本上样于凝胶。电泳进行结束后，取下夹住胶的两块玻璃板中的一块，将胶剪一个角进行加样定向。 (2)用塑料盘内的去离子水轻洗凝胶。倒掉水并加转移缓冲液。孵育凝胶30min。 (4)在另一个塑料盘内加人转移缓冲液。将凝胶、3张滤纸、两块吸水海绵垫放置在含有转移缓冲液的盘中。浸泡2〜3min。 (5)按照生产商的说明准备免疫印迹装置，将电极插人缓冲电泳槽中，在电泳槽的底部放置一个Iin的搅拌棒。 (6)打开凝胶夹，按照下列顺序将海绵，凝胶及滤纸放在凝胶夹的黑色表面上：海绵一滤纸一凝胶一硝酸纤维素膜一滤纸一海绵。确保凝胶面与硝酸纤维素纸相对且在两者之间不能有气泡。闭合此转移夹。 (7)在印迹装置中加人约400ml的转移缓冲液。插人凝胶夹，使其黑面对着电泳槽的黑面。插人冷却装置。 (8)将电泳槽放在磁力搅拌器上并打开搅拌器使其低速搅拌。盖上电泳槽盖。按正确的电极接通电源导线。 (9)打开电源使系统，设置电压为100V。开始时电流应约为250mA，转印快结束时约为350mA，转印约lh。 (10)转印结束后，拿出转印夹，轻轻将转印膜放到一个盛有洗涤缓冲液的塑料盒内，漂洗膜①3次,每次约5min。 (11)于IOml封闭缓冲液中孵育膜30min。如果必要可封闭过夜。封闭后，在洗涤缓冲液中漂洗凝胶3次，每次约5min。 (12)按照下面的描述用封闭缓冲液稀释抗体来准备一抗： (13)纯化的抗体最好用0.5〜I.O^g/ml。 (14)抗血清最好按1:200〜1:5000稀释。 (15)腹水最好按1:500〜I:10〇〇〇稀释。(16)含有单克隆抗体的细胞培养，最好不稀释或者按〗：10〜I:100稀释。 (16)含有单克隆抗体的细胞培养，最好不稀释或者按1：10〜1:100稀释 (17)准备足量的抗体稀释液以覆盖塑料盒中的膜，需15〜20ml。将稀释好的抗体倒在塑料盒中的膜上。将其放在在水平摇床上孵育30min。将摇床设置为低速。 (18)孵育后，用洗涤缓冲液漂洗凝胶3次，每次5min。 (19)准备HRP-交联的二抗。根据来源，按照供应商的建议进行稀释。抗体应该在洗涤液中按1:500〜I:10000稀释。如果浓度过高，有可能发生背景问题，如果浓度过低，可能不能显示含量低的弱条带。 (20)将稀释HRP-交联的二抗加到膜的塑料盒内。将其再次放置于水平摇床上孵育30min。孵育后，用洗涤缓冲液漂洗膜3次，每次5min。 (21)轻轻倒出最后的洗涤液后，加TMB膜底物。孵育2〜lOmin。淡蓝色的条带开始显现出来，此处是特异性抗体-抗原复合物形成的位置。 (22)倒掉酶底物溶液并加人去离子水以终止反应。扫描膜并储存任何有用的结果。例如，扫描结果可以数码形式保存;膜可以进行真空干燥并将其密封在袋里,保存于4℃ |
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