| Product Name | Methoxyresorufin[Resorufin methyl ether] |
| Size | 5 mg |
| Catalog # | AS-85707 |
| US$ | $69 |
Fluorogenic cytochrome P-450 substrate that generates red fluorescent product upon enzyme cleavag
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| Detailed Information |  Material Safety Data Sheets (MSDS) |
| Storage | -20°C desiccated and protected from light |
| References | 1. Donato MT, et al. (2004).Drug Metab Dispos 32, 699-706.2. Liu J, et al. (2004).Arch Biochem Biophys 424, 33-43.3. Chougnet A, et al. (2003).Bioorg Med Chem Lett 13, 3643-5. 4. Dunn AR, et al. (2002).J Am Chem Soc 124, 10254-5.5. Nakamura K, et al. (2001).Anal Biochem 292, 280-6.6. Thapliyal R and Maru GB (2001).Food Chem Toxicol 39, 541-7. 7. Roser R and Thomas H (2000).Z Naturforsch [C] 55, 915-22.8. Kobayashi Y, et al. (1998).Biochemistry 37, 6679-88. |
| Molecular Weight | 227.215 |
| Molecular Formula | C13H9NO3 |
| Spectral Properties | Abs/Em = 571/585 nm |
| Solvent System | DMSO |
| Product Citations | Park, J. et al. (2015). The localization of cytochrome P450s CYP1A1 and CYP1A2 into different lipid microdomains is governed by their N-terminal and internal protein regions JBCdoi: 10.1074/jbc.M115.687103 |
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①动物病毒含有能够被真核细胞识别的有效的启动子.
②有许多种动物病毒,在其感染周期中都能够持续地复制,使其基因组拷贝数达到相当高的水平.
③有些动物病毒具有控制自己复制的顺式元件和反式作用因子.
④有些动物病毒,在它们的复制过程中能高效稳定地整合到寄主核基因组上.
⑤病毒的外壳蛋白质能够识别细胞接受器(acceptor).用病毒外壳蛋白质包装重组质粒DNA形成的假病毒颗粒(pseudovirions),即构成了一种高效的转化体系.
早期基因捕获载体的特点是当报告基因与内源基因的读码框一致时,产生由内源蛋白的N 末端与报告基因蛋白融合的活性蛋白质 。近来对这一类载体所做的改进是在报告基因与SA 序列间插入一来源于脑、心肌炎病毒的IRES ,这样即使报告基因与捕获基因不发生融合也可产生报告基因翻译产物。尽管ES 细胞中大量基因具转录活性,为了获得全基因组突变克隆必须使用不依赖于捕获基因表达的筛选策略。
PCR即聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。
其原理为：
DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。
但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。
耐热DNA聚合酶--Taq酶的发现对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。
PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
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来源：生物谷2016-02-2610:26
2016年2月26日讯/生物谷BIOON/--药物的发现是一项非常艰巨的工作，其需要化学家们从数百万种化合物中筛选最终寻找最适合的那一个，而DNA技术或许就可以明显加速药物的发现之旅。
在麻省沃尔瑟姆市一个普通混凝土楼房二楼的实验室冰箱中保存着一个具有明确标识的检测管，该管中含有天文学数字尺度那么多的混合物，而这些众多的化合物属于制药公司葛兰素史克(GSK)所有，其中包含有1万亿个特殊的DNA标记的分子，其数量是银河系中行星数量的10倍。
这些文库可以帮助制药公司和生物技术公司快速鉴别出可以和疾病蛋白配对的候选药物，尤其是那些很难靶向作用的参与疾病的特殊蛋白质；药物的发现通常都从科学家们开始组装大量的化合物文库开始，随后研究者就会检测这些化合物靶向作用蛋白的效力，这些化合物通常会被加入到每一个包含靶点的孔中来观察是否化合物是否会影响这些靶点的活力，这种方法称之为高通量筛选（high-throughputscreening，HTS），其通常是利用机器人设备自动化地对数百万种化合物进行检测，但目前这种技术的花费非常昂贵，而且有时候并不总是会成功。
过去一些年里，药物化学家已经通过利用条形码样的DNA来对化合物进行标记从而帮助发现更加有用且有效的化合物，这些DNA编码的文库通常会提供多种药物寻找的优势；这样一来研究者们就会将所有DNA标记的分子置于单一的混合制剂中，随后引入靶向蛋白，这样一来结合靶向蛋白的任何一种化合物就会被轻松鉴别出来，而这都得感谢DNA条码的帮助。1992年科学家们首先提出DNA编码文库，DNA编码文库并不会取代高通量筛查技术，很多制药公司目前已经重金投资到了HTS中，而且利用DNA编码技术有时候并不能合成一些化合物，但相比较而言DNA编码技术却会为科学家们提供一种快速、高效且廉价地寻找结合靶点的化合物的技术，比如泛蛋白连接酶，其会对蛋白进行标记并进行处理，同样也可以在癌症疗法中被靶向标记。
大即是美（Bigisbeautiful）
当前GSK公司拥有世界上最大的DNA编码文库（DNA-encodedlibrary），该文库是一般公司200万化合物高通量筛查文库的50万倍。构建DNA编码文库有很多种方法，最大的一种，就像GSK公司的，其是通过利用DNA记录的方法来进行的。化学结构单元，比如氨基酸、胺类和羧酸类，其都可以被合成同时通过化学反应被标记以“DNA条形码”，第二种结构元件就会加入到反应混合物中从而制造一种新分子，同时DNA条形码就会被加长；通过加入四种元件，化学家们就可以开发出药物样的分子，由于存在数千种的结构元件，因此潜在的组合将会是非常巨大的。
相比常规的HTS文库而言，DNA编码文库非常容易维护且使用，一种DNA编码文库可以被储存于单一的检测管中，而HTS文库则需要机器人设施，而相应的设施需要足够大才可以储存每一种化合物。
未来DNA编码文库不仅将会更大更加广泛，而且还会提供很多机会帮助快速应用于临床中去，随着常规筛查的进行，药物化学家们有时候不得不花费数年时间来调节化合物使其变得特殊且安全地用于临床中。相比之下，大尺寸的DNA编码文库意味着科学家们可以寻找到更加适合临床使用的化合物，尽管有些化合物仍然需要优化，但至少科学家们距离成功已经很近了。
其它生物技术公司也相继表示对DNA编码文库非常感兴趣，这些公司不仅利用DNA标签来鉴别特殊化合物，而且以其作为模板来制造新的DNA标签，DavidLiu是来自哈佛大学的一位化学家，他的学生开发出了一种“DNA-模板”方法，同时利用该方法构建了特殊环状分子的文库（macrocycle，包含15个原子以上的大环），这些大型稳定的环状分子可以在多个位点同靶点相互作用，从而增强结合反应的特异性。（GSK和X-Chem公司的DNA编码文库中拥有大量的macrocycle分子）。
首先Liu开发了一种单链DNA模板作为向导，随后将DNA标记的结构元件加入到反应器中，依赖于DNA碱基配对，在物理性上将标记的结构元件从一个结合到另一个，最终的反应就会将线性的结构元件转化成为环状的macrocycle分子，而每一个该分子都会被限制成为特殊的DNA条形码。目前Liu的团队构建的包含14000个大分子的文库已经带来了部分成功，2014年，他们就报道发现了一种特殊稳定的小分子可以有效阻断胰岛素降解酶类（IDE），该酶和2型糖尿病直接相关，为此研究者们还准备研究IDF在健康和疾病中所扮演的角色。
甜蜜的筛选（SweetScreens）
一旦文库建成，下面的乐趣就是鉴别可以吸附靶点的分子了；很多研究依赖于“亲和筛选”来寻找目的化合物，正因为如此他们工程化操作蛋白质使其靶向作用一系列纯化的标签，随后利用纯化标签离开结合对，并且通过包含文库的混合体，最后一步就是利用DNA测序仪来阅读和小分子相关的DNA标识符，这种方法最终就会产生大量的靶向蛋白。但基于亲和的方法往往尤其不足之处，“笨拙”的DNA标记有时候反而会阻碍其同靶点的反应，同时就会使得很多潜在的候选化合物流失，但因为DNA编码文库非常巨大，因此这些损失通常情况下可以被忽略不计；然而有问题的是小分子和其标签通常会结合到纯化柱上，这样就会产生假阳性的结果，纯化的标签也会被靶向蛋白的结构所干扰，从而引入不可靠的数据。
当然很多公司都相继解决了上述问题，Vipergen公司就是其中一个，该公司拥有5000万个分子的DNA模板文库，它们也希望开展这项浓缩的策略；公司的行政总裁NilsHansen表示，试想一下，我们可以冻结蛋白混合物文库并且将其切割成为非常小的小方冰块，如果这些冰块足够小，每一个都包含有单一的靶向蛋白，那么在这个尺寸下进行靶点结合的小分子就会在包含靶点的小方冰块中进行持续过度反应。
当前利用游离漂浮的可溶性蛋白进行DNA编码文库的筛选非常好，但很多潜在的药物靶点都嵌合到了细胞表面，这就使得利用传统的亲和筛查技术变得不太可能，比如大约有40%的被批准的药物都可以靶向作用膜结合的G蛋白偶联受体，因为这些受体分子通常在细胞外部感知分子的存在，为此筛选膜结合蛋白的技术就必须更新换代。其中一种方法就是将DNA编码的文库同完整的可以过度表达膜结合靶点的细胞混合，随后小型分子就会在细胞表面同靶点进行结合；当研究者冲洗掉未结合的文库后，他们就可以通过加热细胞并且阅读被洗脱的DNA标签来鉴别出结合小型分子；在这一方面GSK公司已经利用该方法鉴别出了一系列潜在的受体抑制剂，这些受体参与到了精神分裂症及中枢神经系统障碍的发病中。
当然X-Chem公司也开始看到了进行膜结合蛋白筛查的商机，Wagner表示，从历史观点上来讲，我们的程序主要还是利用可溶性的蛋白，但考虑到最近数据的转变我们已经开发出了相对困难的膜结合蛋白。
未来DNA编码文库的规模还会扩大，而且新型的筛选方法也会打开未知的生物空间，DNA编码文库也将会成为帮助制药公司探索发现新药的支柱之一。（生物谷Bioon.com）
探针的标记方式有放射性标记和非放射性标记。标记物质有放射性元素（如32P等）和非放射性物质（如生物素、地高辛等）。32P是最常用的核苷酸标记同位素，被标记的dNTP本身就带有磷酸基团，便于标记。特点是比活性高，可达9000Ci/mmol；发射的β射线能量高。用它标记的探针自显影时间短，灵敏度高。32P的半寿期短，虽使用不方便，但为废弃物的处理减轻了压力。非放射性标记法有酶标法和化学物标记法。酶标方法与免疫测定ELISA方法相似，只是被标记的核酸代替了被标记的抗体，事实上被标记的抗体也称为探针，现有许多商品是生物素、地高辛标记的。血凝素与生物素有非常高的亲和性，当血凝素标记上过氧化物酶或碱性磷酸酶，经杂交反应最终形成探针-生物素-血凝素酶复合物（ABC法），酶催化底物显色，观察结果。ABC法底物显色生成不溶物，以便观测结果。酶标记法复杂、重复性差，成本高，但便于运输、保存，灵敏度与放射物标记法相当。 ①缺口平移标记法。利用的是DNA聚合酶I能修复DNA链的功能。该法先由DNaseI在DNA双链上随机切出切口，然后DNA聚合酶I沿缺口水解5´端核苷酸，同时在3´端修复加入被标记核苷酸，切口平行推移。缺口平移法快速、简便、成本相对较低、比活性相对较高、标记均匀，多用于大分子DNA标记，(>1000bp最好)，但单链DNA、RNA不能用该法标记。
②随机引物法。随机引物是指含有各种可能排列顺序的寡聚核苷酸片断的混合物，因此它可以与任意核苷酸序列杂交，起到聚合酶反应的引物作用。将待标记的DNA探针片断变性后与随机引物一起杂交，然后以此杂交的寡聚核苷酸为引物，在大肠杆菌DNA聚合酶I大断段（KlenowFragment）催化下，合成与探针DNA互补的DNA链，当在反应体系中含有a-32P-dNTP时，即形成放射性同位素标记的DNA探针。具有上述优点，可代替缺口平移法。此外大小、单双DNA均可标记，标记均匀，标记率高，但也不能标记环状DNA。随机引物法标记探针一般长400~600bp。
③末端标记法（又叫尾标）。利用末端转移酶可进行“尾标”，尾标适用于寡核苷酸探针标记，寡核苷酸探针多用于核酸“点”突变的检测，该探针可用核酸合成仪人工合成，克隆出的探针一般较长，特异性好，标记量大，杂交的检出信号强。 1、4—6微米切片，用防脱片胶（多聚赖氨酸）处理过的玻片贴附
2、56—60℃烤片2—16h
3、新鲜二甲苯脱蜡，10minX2（趁热脱蜡）
4、100%乙醇5minX2次，不用浸水，直接空气干燥
5、加入50μl蛋白酶K工作液（蛋白酶K用蒸馏水稀释，浓度为25μg/ml），37℃消化10—15min
6、弃去蛋白酶K工作液，0.1MTBS洗涤3minX3次逐级酒精脱水（85%，95%，100%酒精）1minX3次然后空气干燥
7、加入20μl探针，加盖薄膜。（探针用预杂交液稀释，浓度为5μg/ml）。
8、95℃变性10—12min；立刻置于冰块上，防止复性。
9、37℃杂交16—20h
10、揭去薄膜，每张切片加入以下杂交后洗涤液：
>用2—3滴2XSSC37℃洗涤3minX2次；
>0.5XSSC37℃洗涤3minX2次；
>0.2XSSC37℃洗涤3minX2次；
11、0.1MPBS/TBS缓冲液洗涤，1minX3次
12、滴加小鼠抗地高辛生物素标记的抗体工作液，37℃孵育45—60min；
13、0.1MPBS浸洗，5minX3次
14、滴加高敏碱性磷酸酶链亲和素复合物工作液，37℃孵育45—60min。
15、0.1MPBS浸洗，5minX3次
16、滴加NBT/BCIP显色6—16h，
17、双蒸水终止反应（37℃10min—2h），双蒸水浸洗，5minX2次
18、滴加核固红，30秒—5min；
19、双蒸水浸洗，5minX3次
20、脱水、透明、封片
