cDNA双链合成1. Superscipt II—RT合成第一链:1. 在一RNase-free的0.2ml PCR管中,加入xul mRNA(大约500ng)1ul Xho I Primer(1.4ug/ul)(5’ GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT…3’)11-x ul RNase-free water（大于500ng mRNA 分n管(500ng/tube)合成第一链, 第一链合成完毕后将n管合成一管进行第二链合成.）2. 混匀后,70℃反应10分钟;3. 反应完成后,立刻将反应体系置于冰上5min;4. 稍微离心一下,顺序加入以下试剂:4ul 5×first strand buffer2ul 0.1M DTT1ul 10mM dNTP(自己配制)5. 混匀，稍微离心反应物之后,42℃放置2分钟;6. 反应完成,趁热加入1 ul Superscipt II—RT,混匀;7. 42℃反应50分钟,然后70℃,15分钟灭活反转录酶.2. cDNA第二链的合成1. 第一链反应完成后,取2ul一链产物－20℃冰箱中保存，待电泳检测。其余的产物合并，混匀，然后顺序加入下列试剂(promega):20ul 10×DNA Polymerase I buffer6ul 10mM dNTP(自己配制)xul dd H2O1ul RNase H(2U/ul)10ul DNA Polymerase I(10U/ul)总体系为200ul;2. 混匀后,16℃反应2.5小时;3. 70℃灭活10分钟;4. 反应完成后,得到200ul cDNA第二链反应体系,将此体系置于冰上;5．取2ul二链产物，同保存的一链产物一起电泳鉴定。同时上1kb ladder，确定双链的大小范围。注：一链，二链的电泳图是smear，且二链稍比一链大一些。3. 双链cDNA末端补平1. 在第二链反应体系中,顺序加入下列试剂(promega):6ul 10mM dNTP2ul T4 DNA Polymerase(8.7U/ul)2ul BSA(10mg/ml)2. 稍微离心混匀反应物, 37℃反应至少30分钟,然后75℃灭活10分钟;3. 加入等体积酚/氯仿/异戊醇,剧烈振荡后,常温下13000g离心5分钟;4. 离心后,吸取上清于另一1.5ml eppendof管中,加入等体积氯仿,上下颠倒几次混匀后,常温下13000g离心5分钟;5. 吸取上清至另一eppendof管,加入1/10V3M NaAc(PH5.2)和2.5V预冷的无水乙醇,混匀,-20℃放置过夜以沉淀双链cDNA;6. 第二日,将昨日沉淀物在4℃,13000g离心60分钟以充分沉淀双链cDNA;7.离心完毕,弃上清,加入1ml 70%乙醇洗涤沉淀,常温下13000g离心5分钟;8.离心完毕,弃上清,干燥沉淀至无乙醇气味.注：第3，第4步可以用PCR 纯化试剂盒代替。PCR纯化试剂盒操作流程：1．溶液PE使用前应加入适量体积95%－100%的乙醇，混匀。2．向200ul二链补平产物中加入5倍体积的buffer PB，混匀。3．加入spin column中，13000rpm离心1min。4．加入0.75ml buffer PE，13000rpm离心1min。5．13000rpm，再离心1min。6．将spin column放入一新的离心管中，加入50ul buffer EB，静置10min。7．13000rpm离心2min。8．加入30ul buffer EB，静置10min。9．13000rpm离心2min。10．加入1/10体积3M的NaAc，2.5倍体积无水乙醇，混匀，－20℃沉淀过夜。4 EcoR I adaptor 加接1. 往双链cDNA沉淀中加入9ul EcoR I adaptor(400ng/ul),4℃至少放置30分钟以充分溶解cDNA沉淀;2. 溶解完成后,顺序加入下列试剂:1.2ul 10×Ligase Buffer1ul 10mM rATP1 ul T4 DNA Ligase(4U/ul)3. 混匀后,4℃连接3days,或者8℃过夜连接;5 双链cDNA末端的磷酸化及Xho I酶切1. 连接反应完成后,将反应体系70℃放置15分钟灭活T4 DNA Ligase;2. 稍微离心使反应物集中至管底,室温下放置5分钟,然后加入下列试剂:1ul 10×Ligase Buffer1ul 10mM rATP6ul dd H2O1ul T4 PNK(10U/ul)3. 37℃反应30分钟,然后70℃灭活15分钟;4. 稍微离心使反应物集中至管底;5. 室温放置5分钟;然后加入下列试剂:4ul Xho 10×Buffer2ul BSA5ul ddH2O8ul Xho I (10U/ul)6. 37℃反应1.5小时,然后65℃灭活酶10分钟;7. 反应完成,双链cDNA合成完毕。置于4℃准备回收。6.胶回收cDNA1．配制小胶数板（每个样品一板）：1%琼脂糖凝胶，2ul EB/300ml 胶2．取4℃保存样品上样，40ul/孔。3．电泳50V；1hr4．紫外灯下分别切下500~1kb、1.0-2.0kb及2.0-4.0kb cDNA 片段.，分别放入已做标记的1.5ml离心管中。5．称取胶重，加入三倍体积buffer QXI（例如，100mg胶中加入300ul buffer QXI）6．50℃ 水浴数分钟，至胶完全融化。用手指弹 QIAEX II 使重悬，每管中加入5ul QIAEXII7．50℃ 水浴10min，每隔2min 取出颠倒混匀数次，使QIAEX II 保持悬浮8．4℃，13000rpm，30sec。（弃上清，离心机中甩一下，吸取上清）9．加入500ul buffer QXI，轻弹管底使QIAEX II 重悬10． 离心并去上清（同操作8）11． 加入500ul buffer PE，重悬QIAEX II，离心30sec，去上清12． 再加入500ul buffer PE，重悬QIAEX II，离心30sec，弃上清，离心机中甩一下，吸去上清13． 超净台上吹干（至无乙醇味），加入10ul elution buffer，重悬QIAEX II，静置5min，13000rpm，30sec。吸上清，冰上放置。14． 取1ul上清上样电泳，同时做分子量标准（1kb ladder）及DNA含量标准（10ng，20ng）作对照。15． 将收回的cDNA置于-20℃内保存，据电泳结果，取适量DNA进行连接。注意事项：1．胶回收前电泳槽，电泳板，梳子等都要用1%的HCl浸泡过夜。2．胶回收时电压要稳定。 第一链的合成oligo(dT)引导的DNA合成法:利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性,加入12-20个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的oligo(dT)短片段,由反转录酶合成cDNA的第一链.缺 陷:因为逆转录酶无法到达mRNA分子的5'-末端,必须从3'-末端开始合成cDNA.对于大分子量的较长的mRNA分子而言,特别麻烦.随机引物引导的cDNA合成法 (randomly primed cDNA synthesis) :根据许多可能的序列,合成出6-10个核苷酸长的寡核苷酸短片段(混合物),作为合成第一链cDNA的引物.在应用这种混合引物的情况下,cDNA的合成可以从mRNA模板的许多位点同时发生,而不仅仅从3'-末端的oligo(dT)引物一处开始. 第二链的合成第一链的合成反应完成后，得到DNA/RNA杂交分子，在DNA聚合酶的作用下，以第一链为模版，合成cDNA的第二链。 变性降解除去杂交分子中的RNA,单链cDNA的3'端能够形成发夹状的结构作为引物,在大肠杆菌聚合酶I Klenow或反转录酶的作用下,合成cDNA的第二链.缺 点:在以S1核酸酶切割cDNA的发夹状结构时,会导致对应于mRNA 5'端的地方的序列出现缺失和重排. S1核酸酶的纯度不够时,会偶尔破坏合成的双链cDNA分子.自身引导法合成双链cDNA 原 理:以第一链合成产物cDNA:mRNA杂交体作为切口平移的模板,RNA酶H在杂交体的mRNA链上造成切口和缺口,产生一系列RNA引物,在大肠杆菌DNA聚合酶I的作用下合成cDNA的第二链.优点:a)合成cDNA的效率高b)直接利用第一链的反应产物,不需纯化c)避免使用S1核酸酶来切割双链cDNA3,引物-衔接头法