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请教一下：建立CDNA文库目前方法很多，试剂盒的种类也非常繁杂。我想用固相法来建立文库，即利用磁珠的吸附特性合成。但不清楚这样的操作是否容易控制反应条件？另外，这样作出的库容量是否能达到较高？磁珠的应用对库容的影响到底大不大？不知哪位高手做过这方面的实验，烦告知！不胜感激！

最近用Clontech的Smart技术，构建了肾组织的CDNA文库，库容量还行，3*106cfu，随机挑选了74个克隆进行测序，结果发现，其中有28个mtDNA转录产物，咨询了公司后，也不知道什么原因，理论上存在mtRNA也是可以理解的，但是为什么会有如此高的比例，真是百思不得其解，公司让在cDNA合成前，去掉mtRNA，怎么去得了啊，这到底怎么造成了？

网站在线客服软件回头客CRM有这些特点。
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我正在用clontech公司的SMART技术构建CDNA文库,我RNA提取用的TRIZOL,取的癌组织,标本离体后放冰盒,一小时后按比例加TRIZOL用剪刀剪碎,放-20过夜,其他步骤完全按说明进行.提的RNA跑胶还可以,ss-cDNA也还可以,可LD-PCR时就出不来.想请高手帮帮小弟.现附上电泳图.

他说的对啊

各位大侠帮帮忙
指点一些关于全长CDNA文库构建的知识

看了一些论文和文章还是挺迷惑的，希望有人指点一下各个步骤有什么要注意的，难点是什么

cDNA文库构建过程中，由总RNA反转录得cDNA和走mRNA路线得cDNA有什么影响吗？
哪个公司的试剂盒比较好？
（我做的是苔藓植物）

CDNASizeFractionation做完后的电泳检测，发现条带的大小都在5000bp左右，感觉是哪里有问题。前面步骤检测很好。不知道有问题没有？请哪位高人指点一下。

一、 DNA文库和cDNA文库的概念
将某种生物的基因组DNA切割成一定大小的片段，并与合适的载体重组后导入宿主细胞进行克隆。这些存在于所有重组体内的基因组DNA片段的集合，即基因组文库，它包含了该生物的所有基因。
以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。
二、 DNA文库和cDNA文库的构建原理
DNA文库：用限制性内切酶切割细胞的整个基因组DNA，可以得到大量的基因组DNA片段，然后将这些DNA片段与载体连接，再转化到细菌中去，让宿主菌长成克隆。这样，一个克隆内的每个细胞的载体上都包含有特定的基因组DNA片段，整个克隆群体就包含基因组的全部基因片段总和称为基因组文库。
cDNA文库：以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的载体常用噬菌体或质粒载体连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。
三、DNA文库和cDNA文库的用途
基因组含有的基因在特定的组织细胞中只有一部分表达，而且处在不同环境条件、不同分化时期的细胞其基因表达的种类和强度也不尽相同，所以cDNA文库具有组织细胞特异性。cDNA文库显然比基因组DNA文库小得多，能够比较容易从中筛选克隆得到细胞特异表达的基因。但对真核细胞来说，从基因组DNA文库获得的基因与从cDNA文库获得的不同。DNA文库所含的是带有内含子和外显子的基因组基因，而从cDNA文库中获得的是已经过剪接、去除了内含子的cDNA展开

cDNA双链合成
1. Superscipt II—RT合成第一链:
1. 在一RNase-free的0.2ml PCR管中,加入
xul mRNA(大约500ng)
1ul Xho I Primer(1.4ug/ul)
(5’ GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT…3’)
11-x ul RNase-free water
（大于500ng mRNA 分n管(500ng/tube)合成第一链, 第一链合成完毕后将n管合成一管进行第二链合成.）
2. 混匀后,70℃反应10分钟;
3. 反应完成后,立刻将反应体系置于冰上5min;
4. 稍微离心一下,顺序加入以下试剂:
4ul 5×first strand buffer
2ul 0.1M DTT
1ul 10mM dNTP(自己配制)
5. 混匀，稍微离心反应物之后,42℃放置2分钟;
6. 反应完成,趁热加入1 ul Superscipt II—RT,混匀;
7. 42℃反应50分钟,然后70℃,15分钟灭活反转录酶.
2. cDNA第二链的合成
1. 第一链反应完成后,取2ul一链产物－20℃冰箱中保存，待电泳检测。其余的产物合并，混匀，然后顺序加入下列试剂(promega):
20ul 10×DNA Polymerase I buffer
6ul 10mM dNTP(自己配制)
xul dd H2O
1ul RNase H(2U/ul)
10ul DNA Polymerase I(10U/ul)
总体系为200ul;
2. 混匀后,16℃反应2.5小时;
3. 70℃灭活10分钟;
4. 反应完成后,得到200ul cDNA第二链反应体系,将此体系置于冰上;
5．取2ul二链产物，同保存的一链产物一起电泳鉴定。同时上1kb ladder，确定双链的大小范围。
注：一链，二链的电泳图是smear，且二链稍比一链大一些。
3. 双链cDNA末端补平
1. 在第二链反应体系中,顺序加入下列试剂(promega):
6ul 10mM dNTP
2ul T4 DNA Polymerase(8.7U/ul)
2ul BSA(10mg/ml)
2. 稍微离心混匀反应物, 37℃反应至少30分钟,然后75℃灭活10分钟;
3. 加入等体积酚/氯仿/异戊醇,剧烈振荡后,常温下13000g离心5分钟;
4. 离心后,吸取上清于另一1.5ml eppendof管中,加入等体积氯仿,上下颠倒几次混匀后,常温下13000g离心5分钟;
5. 吸取上清至另一eppendof管,加入1/10V3M NaAc(PH5.2)和2.5V预冷的无水乙醇,混匀,-20℃放置过夜以沉淀双链cDNA;
6. 第二日,将昨日沉淀物在4℃,13000g离心60分钟以充分沉淀双链cDNA;
7.离心完毕,弃上清,加入1ml 70%乙醇洗涤沉淀,常温下13000g离心5分钟;
8.离心完毕,弃上清,干燥沉淀至无乙醇气味.
注：第3，第4步可以用PCR 纯化试剂盒代替。
PCR纯化试剂盒操作流程：
1．溶液PE使用前应加入适量体积95%－100%的乙醇，混匀。
2．向200ul二链补平产物中加入5倍体积的buffer PB，混匀。
3．加入spin column中，13000rpm离心1min。
4．加入0.75ml buffer PE，13000rpm离心1min。
5．13000rpm，再离心1min。
6．将spin column放入一新的离心管中，加入50ul buffer EB，静置10min。
7．13000rpm离心2min。
8．加入30ul buffer EB，静置10min。
9．13000rpm离心2min。
10．加入1/10体积3M的NaAc，2.5倍体积无水乙醇，混匀，－20℃沉淀过夜。
4 EcoR I adaptor 加接
1. 往双链cDNA沉淀中加入9ul EcoR I adaptor(400ng/ul),4℃至少放置30分钟以充分溶解cDNA沉淀;
2. 溶解完成后,顺序加入下列试剂:
1.2ul 10×Ligase Buffer
1ul 10mM rATP
1 ul T4 DNA Ligase(4U/ul)
3. 混匀后,4℃连接3days,或者8℃过夜连接;
5 双链cDNA末端的磷酸化及Xho I酶切
1. 连接反应完成后,将反应体系70℃放置15分钟灭活T4 DNA Ligase;
2. 稍微离心使反应物集中至管底,室温下放置5分钟,然后加入下列试剂:
1ul 10×Ligase Buffer
1ul 10mM rATP
6ul dd H2O
1ul T4 PNK(10U/ul)
3. 37℃反应30分钟,然后70℃灭活15分钟;
4. 稍微离心使反应物集中至管底;
5. 室温放置5分钟;然后加入下列试剂:
4ul Xho 10×Buffer
2ul BSA
5ul ddH2O
8ul Xho I (10U/ul)
6. 37℃反应1.5小时,然后65℃灭活酶10分钟;
7. 反应完成,双链cDNA合成完毕。置于4℃准备回收。
6.胶回收cDNA
1．配制小胶数板（每个样品一板）：1%琼脂糖凝胶，2ul EB/300ml 胶
2．取4℃保存样品上样，40ul/孔。
3．电泳50V；1hr
4．紫外灯下分别切下500~1kb、1.0-2.0kb及2.0-4.0kb cDNA 片段.，分别放入已做标记的1.5ml离心管中。
5．称取胶重，加入三倍体积buffer QXI（例如，100mg胶中加入300ul buffer QXI）
6．50℃ 水浴数分钟，至胶完全融化。用手指弹 QIAEX II 使重悬，每管中加入5ul QIAEXII
7．50℃ 水浴10min，每隔2min 取出颠倒混匀数次，使QIAEX II 保持悬浮
8．4℃，13000rpm，30sec。（弃上清，离心机中甩一下，吸取上清）
9．加入500ul buffer QXI，轻弹管底使QIAEX II 重悬
10． 离心并去上清（同操作8）
11． 加入500ul buffer PE，重悬QIAEX II，离心30sec，去上清
12． 再加入500ul buffer PE，重悬QIAEX II，离心30sec，弃上清，离心机中甩一下，吸去上清
13． 超净台上吹干（至无乙醇味），加入10ul elution buffer，重悬QIAEX II，静置5min，13000rpm，30sec。吸上清，冰上放置。
14． 取1ul上清上样电泳，同时做分子量标准（1kb ladder）及DNA含量标准（10ng，20ng）作对照。
15． 将收回的cDNA置于-20℃内保存，据电泳结果，取适量DNA进行连接。
注意事项：
1．胶回收前电泳槽，电泳板，梳子等都要用1%的HCl浸泡过夜。
2．胶回收时电压要稳定。 第一链的合成
oligo(dT)引导的DNA合成法:
利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性,加入12-20个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的oligo(dT)短片段,由反转录酶合成cDNA的第一链.
缺 陷:
因为逆转录酶无法到达mRNA分子的5'-末端,必须从3'-末端开始合成cDNA.对于大分子量的较长的mRNA分子而言,特别麻烦.
随机引物引导的cDNA合成法 (randomly primed cDNA synthesis) :
根据许多可能的序列,合成出6-10个核苷酸长的寡核苷酸短片段(混合物),作为合成第一链cDNA的引物.在应用这种混合引物的情况下,cDNA的合成可以从mRNA模板的许多位点同时发生,而不仅仅从3'-末端的oligo(dT)引物一处开始. 第二链的合成
第一链的合成反应完成后，得到DNA/RNA杂交分子，在DNA聚合酶的作用下，以第一链为模版，合成cDNA的第二链。 变性降解除去杂交分子中的RNA,单链cDNA的3'端能够形成发夹状的结构作为引物,在大肠杆菌聚合酶I Klenow或反转录酶的作用下,合成cDNA的第二链.
缺 点:
在以S1核酸酶切割cDNA的发夹状结构时,会导致对应于mRNA 5'端的地方的序列出现缺失和重排. S1核酸酶的纯度不够时,会偶尔破坏合成的双链cDNA分子.
自身引导法合成双链cDNA 原 理:
以第一链合成产物cDNA:mRNA杂交体作为切口平移的模板,RNA酶H在杂交体的mRNA链上造成切口和缺口,产生一系列RNA引物,在大肠杆菌DNA聚合酶I的作用下合成cDNA的第二链.
优点:a)合成cDNA的效率高
b)直接利用第一链的反应产物,不需纯化
c)避免使用S1核酸酶来切割双链cDNA
3,引物-衔接头法

cDNA文库是通过RNA反转录得来的，真核生物含有内含子(即转录为RNA后会被剪掉不表达的部分)，而原核生物不含内含子，所以cDNA文库适用于真核生物，基因组文库适用于原核生物

附件里是我反转录的CDNA片段，过柱后，基本上去除了500bp以下的小片段。我用的是BDclontechCo的libraryconstructKit，我不是很清楚该选择哪几个管子的cDNA去装载体比较好？
DNAmark是TakaraCo的DL2000（2000，1000，750，500，200，100）。
谢谢各位用过此kit的战友指点！

基因组文库是含有某种生物体全部基因的随机片段的重组DNA克隆群体；cDNA文库是指含有所有重组cDNA的克隆群体。