| 实验方法原理 | |||||||||||
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| 实验材料 | PK-120 试剂、试剂盒 | Sephadex-50GeneAmpRNAPCR试剂盒合成寡聚核苷酸抽提液酵母tRNA 仪器、耗材 | PCR扩增仪 实验步骤 | 实验所需「试剂」具体见「其他」 1.引物设计 PK-120部分分解多肽氨基酸序列中，最长序列K-15，16为引物设计的依据： 1.1考虑全部编码的组合， 1.2考虑人编码的使用频率，设计PCR引物，正义链及反义链如用这些引物获得的PCR产物当中，50bp的产物为目的CDNA。 2.PCR扩增 从肝脏来源的poly（A）+RNA中，用GeneAmpRNAPCR试剂盒如以下所述，合成cDNA0.1ug的poly（A）+RNA中，加入5mmol/LMgCl2： 2mmol/LdNTPs， 1u的RNaseinhibitor， 2.5umol/Lrandomhexamers 2.5u反转录酶， 混匀，总体积为20ul。 在PCR扩增仪上反应，PCR参数为： 25℃10min， 42℃30min， 99℃5min， 25℃5min， 第1循环反应，合成cDNA。 在反应液中再分别加终浓度为2mol/LMgCl2，1×PCR缓冲液Ⅱ，加1nmol3"引物5"引物。混合，总体积为100ul。 94℃3min1循环。 94℃1min， 37℃～42℃，2min， 72℃，2min， 40循环。 72℃，7min，1循环。 3.凝胶电泳及提取DNA 纯化PCR产物后，在0.25×TBE溶液中，进行10％聚丙烯酰胺凝胶电泳，分子量标准使用限制性酶Msp1消化的质粒pBR322。电泳结束后，凝胶经溴化乙锭染色，紫外照射，观察到50bp的PCR产物。将这50bp的条带切下，在抽提液中，室温放置过夜之后1200r/min4℃离心10min，回收上清。反复操作两次，用乙醇沉淀2次，用TE液溶解，上样Sephadex-50柱，再用乙醇沉淀洗脱组分，沉淀悬浮于TE溶液中。 4.测定碱基序列 抽取提出的PCR产物用PCRⅡ载体亚克隆，测定碱基序列。其结果以肝脏polymRNA为模板，据引物S15-i和A15-i扩增的50bp的PCR产物序列，和从氨基酸序列预测的碱基序列完全一致。表明这是编码母的部分分解多肽的cDNA。 注意事项 | 其他 | 试剂： Sephadex-50 GeneAmpRNAPCR试剂盒 合成寡聚核苷酸用BIO-SYNTHESIS，INC公司产品合成寡聚核苷酸 抽提液 750mmol/L醋酸铵-10mmol/L醋酸镁-0.1mmol/LEDTA-0.1％SDS-1％TE饱和酚 25ug/ml酵母tRNA 其他他试剂均为市售 |
