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| 试剂、试剂盒 | ddH20Vent缓冲液VentDNA聚合酶dNTP引物质粒DNA 仪器、耗材 | 琼脂糖凝胶电泳所需的试剂和设备热循环仪 实验步骤 | 一、材料 1.缓冲液、溶液和试剂 ddH20 2.酶和酶缓冲液 10XVent缓冲液 VentDNA聚合酶 3.核酸和寡核苷酸 dNTP，各20mmol/L 引物，可以与合成的DNA文库克隆位点两侧的载体序列退火 质粒DNA(见下面第1步） 4.特殊设备 琼脂糖凝胶电泳所需的试剂和设备，包括溴化乙锭(见第5步） 热循环仪 二、方法 1.在细菌中扩增后，用随机多肽文库制备的质粒进行下面的反应。 10~50ng的质粒DNA 50pmol的各引物 5ul的10XVent缓冲液 dATP、dCTP、dTTP和dGTP,各0.5ul 1U的VentDNA聚合酶 用ddH20定容至50ul 下面的各种质粒载体，应该分别进行反应： 表达载体，没有文库DNA插入 DNA文库的混合物 少量DNA，由DNA文库的单个细菌克隆制备 2.在一个热循环仪中，94°C将混合物预热20s。 3.按下面的参数进行30轮PCR循环。 94°C10s 55°C10s(或用引物的合适退火温度） 72°C15s 将最后一个循环的延伸时间延长至30s。 4.冷却至4°C。 5.取25ul的各反应产物，跑4%的琼脂糖凝胶电泳，并用溴化乙锭染色分析（Sam-brookandRussell2001) 三、分析 在图26-4所示的例子中，用12个核苷酸的随机文库混合物作为模板，分析PCR产物显示，  文库的大部分都含有正确大小的插入（图26-4，第2泳道）。而且，检测不到与原始载体对应的PCR产物（比较图26-4第1泳道和第2泳道）。用PCR分析随机选择的文库中的单个克隆，证实绝大部分插入片段大小是正确的，而且文库中没有原始载体的污染（图26-4，第3~20泳道）。分析DNA的序列证实，这些PCR产物正是12个核苷酸随机文库的正确成员（数据没有列出）。因此，对反应中间产物（方案2图26-3)进行PCR分析后估计，已经获得了高质量的最终文库（图26-4)。 |
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发布于 ： 2018-08-06
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