双向电泳操作步骤——第一向凝胶资讯
| 实验材料 | 蛋白质 试剂、试剂盒 | 丙烯酰胺TEMED磷酸过硫酸铵溴酚蓝NaOH 仪器、耗材 | 电泳仪离心机 实验步骤 | 1. 在干净的1.5mm内径的凝胶柱管上作好标记以指示应灌制凝胶柱的髙度。用橡皮筋将凝胶柱管捆绑成束，在一水平面上垂直竖起管束，从其顶部向下推压，使各柱管的底部平齐。 2. 用三、四层Parafilm膜小心封好2.5~3.0cm内径的凝胶灌制管的一端，使之形成一个结实的水密性的密封面。 3. 将凝胶柱管束放入凝校灌制管内，用环形支架和夹子将灌制管固定在垂直的位置，并使其密封端置于一水平面之上。 4. 加8.25g尿素、6.0ml水、2.0ml30%丙烯酰胺/1.8%亚甲双丙烯酰胺、0.75mlpH4~8的Ampholytes两性电解质于一个小的真空瓶中。瓶内加一小搅棒，将瓶子置于磁力搅拌器的温水浴中，搅拌至尿素全溶于水，不要加热使溶液温度超过30℃。 5. 在强真空下脱气2~3min，加入0.3mlNP-40，摇晃使之溶解混匀。 6. 将溶液倒入带0.2或0.45μm针头式滤器的注射器中，推压使之通过滤器。加入10μlTEMED，摇匀；再加70μl过硫酸铵，摇匀。立即用吸管将溶液加入到凝胶柱管和大的凝胶灌制管之间的空间。 7. 用一洗瓶轻轻地在凝胶往管的外面加入水，直至将丙烯酰胺溶液压进拄管至所设定的高度，放置使凝胶聚合。 8. 取去凝胶灌制管底部的Parafilm膜从底部将含有聚合好凝胶的凝胶管推出，用单刃刀片切去管子底部多余的丙烯酰胺。并在流动的去离子水下冲洗，除去残余的丙烯酰胺。 9. 在每根管子的顶部套上橡皮扣眼，留意在扣眼下仍可看见凝胶的顶部，在扣眼上需留约5mm凝胶管。 11. 往下缓冲液槽加入大约3L0.085%的磷酸。 12. 将上、下缓冲液槽安放在一起，调整下缓冲液槽使液面盖没凝胶。 13. 上缓冲液槽加入250ml0.02mol/l的NaOH，用带22G皮下针头的1ml注射器将凝胶管的顶部用0.02mol/l的NaOH充满，小心排去凝胶管中的所有气泡。 14. 连接电源，黑色的导线接于上槽。在200V恒压下预聚集1h撤开电泳槽与电源的连接。 15. 用50ml注射器将10~30μl蛋白质样品穿过凝胶管上的缓冲液直接加在凝胶的表面。 16. 盖上上槽盖后，连接电源。打开电源调到设定电压，恒压电泳16h。 17. 将电压调到零位，关闭电源，结束电泳。用50μl注射器往毎根凝胶的顶部加入约1μl浓溴酚蓝溶液。 |
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发布于 ： 2021-07-27
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