铸分离胶（下层胶)

装置的清洗
为使角蛋白的污染减至最少，将玻板、梳子和隔条浸泡在含强碱性去垢剂〔2%RBS35液（PierceChemicalCo.)〕提浓物的水溶液（每1000ml水加20ml提浓物中。可将去垢剂溶液置于一带盖的盆中，盆中放一支架，将玻板悬置于支架上至少保持10min(或过夜)。此外，努力保持凝胶材料和溶液尽可能是无尘的。有时要用缓冲液对吸管进行预冲洗，以除去可能沉积于吸管内的灰尘颗粒。操作时要一直戴手套并经常变动它们的位置。用不会留下颗粒的纸巾（如Kimwipes纸巾）擦干玻板，或用甲醇或丙酮洗涤玻板并在通风橱中风干。

分离胶的混合
在对待测蛋白质的大小所作最佳估计的基础上，选择合适的丙烯酰胺浓度。下表概括了制备不同百分比的丙烯酰胺/双丙烯酰胺混合物所需成分的用量。表的上方给出了最小待测蛋白质的分子量范围。



分离胶的灌注
1)将丙烯酰胺/双丙烯酰胺、H₂0、4x分离胶缓冲液混合于带侧臂口的小号(25ml）爱伦美氏烧瓶。

2)用塞塞住瓶口，混合物真空脱气10min。

3)加APS,温和但彻底混匀。尽量避免产生气泡。

4)加TEMED。温和但迅速混匀。

5)用经水预洗净的巴氏吸管灌注胶液，直至液面高度离玻板顶部约1cm处。

6)用预洗净的巴氏吸管在胶液上面均匀布一层异丁醇（2-甲基-1-丙醇）。异丁醇层应高约2mm。

7)分离胶至少聚合1h。

铸压缩胶（上层胶）

压缩胶的混合



压缩胶的灌注
1)将丙烯酰胺/双丙烯酰胺、H2O、4x分离胶缓冲液混合于带侧臂口的小号(25ml)爱伦美氏烧瓶。

2)用塞塞住瓶口，混合物真空下脱气10min。

3)分离胶聚合后，倾出上层液体异丁醇和未聚合的丙烯酰胺。

4）用蒸馏、去离子水洗涤胶的上部。

5)用压缩胶液洗涤胶的上部。

6)将梳子插入玻板之间。

7)加APS,温和但彻底混匀。努力避免产生气泡。

8)加TEMED。温和但迅速混匀。

9)用预先经水洗净的巴氏吸管灌注压缩胶液。

压缩胶应在10mm内聚合。在2h内使用。

电泳

样品的制备
1)将沉淀或冻干的各样品分别置于1.5-ml具盖聚丙烯离心管中，各加入5~20ul含2-巯基乙醇的1X样品缓冲液（配方见p.257)。短暂震荡混合后立即置于沸水浴中支架上5min。

2）样品冷却至室温，微型离心机短暂离心（~10s)。

加样
1）小心地取出梳子，将聚合的凝胶安置于电泳槽中。上、下槽中加入电泳缓冲液(1X)(配方见PP.256~257)，确保每个样品孔中都充满缓冲液。小心地去除样品孔中的所有气泡或额外的聚丙烯酰胺碎片。

2)每个样品按合适的体积加样，对于0.15cm厚的胶，通常最多加15ul样品因样品含10%甘油，样品会通过样品孔中的缓冲液而沉入孔底。

3)当心样品不要溢出至样品孔间的分隔部而混合。用自动移液器上样应用出口极细的吸头，每个样品换一个吸头。

电泳
1)将电极导线接至电源，黑的接于负极，红的接于正极pH8.3时，与SDS结合的蛋白质荷负电，它们将向正极迁移。

2)压缩胶部分每块胶以8mA电流（恒流)电泳。若两块胶在一个电泳槽内同时进行电泳，则以16mA电流进行电泳。在压缩胶/分离胶界面处，蛋白质样品将压缩成一窄带。

3)当溴酚蓝进入分离胶时，每块胶的电流增至18mA。

4)溴酚蓝达到胶的底部时，即关掉电源，停止电泳。不应让溴酚蓝跑出底部。

溶液和缓冲液的配制

丙烯酰胺/双丙烯酰胺储液（30:0.8）(1000ml)

30%(w/v)丙烯酰胺300g

0.8%(w/v)双丙烯酰胺8g

加去离子蒸馏水，至终体积1000ml。经0.22-um膜过滤。存于4°C暗处。

分离胶缓冲液（4x)

1.5mol/LTris-HCl(pH8.0)

0.4%(w/v)SDS



加去离子蒸馏水,至所需终体积。室温下用HCl调pH至8.8。经0.22-um膜过滤。存于4°C

压缩胶缓冲液(4X)

0.5mol/LTris-HCl(pH6.8)

0.4%(w/v)SDS



加去离子蒸馏水,至所需终体积。室温下用HC1调pH至6.8。经0.22-um膜过滤。存于4°C。

电极缓冲液(4X)

0.1mol/LTris

0.768mol/L甘氨酸



加去离子蒸馏水，至所需终体积。不必调pH。此比例时Tris碱-甘氨酸的pH应为8.3。室温下存于大容器（酸坛）中。

SDS(10%;w/v)

(100ml)

取10gSDS溶于去离子蒸馏水中，至终体积100ml。室温下存于洁净瓶中。

电泳缓冲液（1X)

1/4体积的4x电极缓冲液与3/4体积的去离子蒸馏水混合。然后加1/100体积的10%SDS至终浓度0.1%(w/v)SDS。实例如下：



样品缓冲液(2X)储液

0.25mol/LTris-HCl(pH6.8)

4%(w/v)SDS

20%（v/v)甘油

痕量溴酚蓝

配制此缓冲液时，应极小心，戴手套，并避免角蛋白（皮肤上即存在此蛋白)对缓冲液的污染。



加H₂O至100ml终体积。此缓冲液可室温下保存或等分冻干保存，但用前必须温热以确保SDS于溶液中。应保证反复使用此溶液的同一储液而不被污染。等分保存将有助于避免这个问题。

含2-巯基乙醇的样品缓冲液（1X)

用前配制样品缓冲液的工作液，稀释2X样品缓冲液储液（见上，加入2-巯基乙醇至终浓度为5%(v/v)。例如：

2x样品缓冲液储液                               100ul

H₂0                            90ul

2-巯基乙醇                                           10ul/200ul

过硫酸铵(APS)(10%;W/V）

取3g过硫酸铵，溶于去离子蒸馏水，至终体积为30ml。此溶液4°C下在短暂的数日内是稳定的，但建议，对每一组新胶均应新鲜配制。