大鼠大脑皮质神经元的原代培养《福建医科大学学报》2008年02期
| 实验方法原理 | 碱性琼脂糖凝胶电泳是在高pH条件下进行的，它能引起胸腺嘧啶和鸟嘌呤残基丢失一个质子，从而阻止与其各自的配对碱基-腺嘌呤和胞嘧啶间氢键的形成。变性的DNA保持单链状态，根据其分子大小在碱性琼脂糖凝胶中泳动。其他的变性剂如甲酰胺和尿素由于能引起琼脂糖橡胶化，因此结果往往较差。 | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 实验材料 | DNA样品 试剂、试剂盒 | 琼脂糖碱性琼脂糖电泳缓冲液碱性凝胶载样缓冲液乙醇溴化乙锭或SYBRGold染色液碱性琼脂糖凝胶中和溶液乙酸钠TAE电泳缓冲液 仪器、耗材 | 玻璃板水浴 实验步骤 | 一、材料 1.缓冲液和溶液 琼脂糖 10X碱性琼脂糖电泳缓冲液（500mmol/LNaOH，10mmol/LEDTA） 6X碱性凝胶载样缓冲液（300mmol/LNaOH，6mmol/LEDTA，18%(m/V)Ficoll-400(Pharmacia公司），0.15%（m/V)溴甲酚绿，0.25%(m/V)二甲苯氰） 乙醇 溴化乙锭或SYBRGold染色液 碱性琼脂糖凝胶中和溶液（1mol/LTris-Cl（pH7.6)，1.5mol/LNaCl） 乙酸钠（3mol/LpH5.2) 1XTAE电泳缓冲液 2.核酸和寡核苷酸 DNA样品（通常放射性标记） 3.专用设备 玻璃板 预置温度55℃的水浴  二、方法 1.在三角烧瓶或玻璃瓶中加入准确量的琼脂糖粉和定量的水制备琼脂糖溶液。 2.在烧瓶的瓶颈上轻轻地塞上Kimwipes纸。如用玻璃瓶，瓶塞须拧松。在沸水浴或微波炉中将混悬液加热至琼脂糖溶解。 3.使清亮的溶液冷却至55℃。加0.1倍体积的10X碱性凝胶电泳缓冲液，迅速灌制凝胶。当凝胶完全凝固后，置电泳槽中，加入新配制的1X电泳缓冲液至恰好盖没凝胶。 4.用常规乙醇沉淀的方法收集DNA样品。加入10~20μl1X凝胶缓冲液溶解沉淀，再加0.2倍体积6X碱性凝胶载样缓冲液。 5.将溶于6X碱性载样缓冲液的DNA样品加至加样孔中。以<3.5V/cm的电压开始电泳，当溴甲酚绿迁移0.5~1cm时，关闭电源。在凝胶上面放置一块玻璃板，继续电泳至染料迁移了凝胶长度的近2/3时，停止电泳。 6.根据实验目的，按照下面介绍的程序之一处理凝胶。 (1)Southern杂交 ①将凝胶放在中和溶液室温浸泡45min。将DNA转移至不带电荷的硝酸纤维素或尼龙膜上。 ②通过相应的标记探针对膜上固相化的DNA进行杂交检测。 (2)染色 ①将凝胶放在中和溶液室温浸泡45min。 ②用含0.5μg/ml溴化乙锭的1XTAE或SYBRGold染色液染中和过的凝胶。 湿胶的放射自显彩：按下面专栏介绍的一种方法进行操作。   |
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发布于 ： 2018-08-06
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