| 实验方法原理 | 蛋白质链间或链内完整的二硫键，会给酶解或化学裂解带来麻烦。如： 1.二硫键连接的肽段洗脱物，在基于RP-HPLC的肽段作图中会产生单个的峰，从而使这些肽段图很难解释； 2.最理想的方法是在序列测定之前，分离由S—S键连接的肽段，否则会使序列数据的解释变得复杂； 3.没有断裂二硫键的蛋白质不便于蛋白质的片段化。 用于断裂二硫键的最普通方法，是将胱氨酸还原成半胱氨酸残基。可是，半胱氨酸残基具有很高的反应性，导致序列测定变得复杂（比如，形成随机二硫键，以及在去掉还原剂后很容易被氧化）。基于这个原因，通常要使它们变成稳定的衍生物（如通过烷化作用）。 在本方案中，完整的蛋白质（>lmg)首先被还原，然后被碘乙酸（或碘乙酰胺）S-羧甲基化，得到半胱氨酸衍生物S-羧甲基胱氨酸（或S-羧甲基半胱氨酸），利用化学测序方法很容易检测。另一种常用的烷基化试剂是4-乙烯基吡啶，产生4-乙烯基吡啶半胱氨酸（RafteryandCole,1996)。4-乙烯基吡啶半胱氨酸很容易通过Edman降解法（作为PTH衍生物）和基于质谱的序列测定方法加以检测。对于微量蛋白质（<100ug）的还原和S-羧甲基化，见方案3。 | ||||||
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| 实验材料 | 冻干的纯化蛋白样品 试剂、试剂盒 | 乙酸（1molL)(超纯级）烷基化缓冲液NH4HCO3二硫苏糖醇（DTT)盐酸胍浓HCl碘乙酸β-巯基乙醇N'N-乙基吗啉乙酸缓冲液还原缓冲液 仪器、耗材 | 层析系统和尺寸排阻柱氮气pH试纸聚丙烯管聚乙烯管 实验步骤 | 一、样品还原1.在还原缓冲液中，溶解蛋白质样品（约10mg蛋白/ml)。 2.加入准确称量的物质的量大约是蛋白质60倍的固体DTT(比如，大约是蛋白质重量的一半），或使其终浓度为0.lmol/L。 3.在溶液上方轻轻吹氮气（或氩气）30s。 可以在氮气罐调节阀的聚乙烯塑料管口接一根巴斯德吸管，调节氮气流以至于手背基本觉察不到。 4.37°C孵育蛋白质溶液3h。 5.如果需要，-SH基团的数量可以用Ellman法测定（见方案4)。 二、样品烷基化有些情况下，经还原和烷基化的蛋白质可以通过RP-HPLC迅速脱盐，然后在少量易挥发溶剂中复性。这种方法对于低分子质量（10~25kDa)的蛋白质，比如生长因子和细胞因子尤为有效。利用RP-HPLC(TFA/乙腈溶剂系统）脱盐（和样品浓缩），已经成功地应用于微量样品（见方案3)。 6.在冰上冷却、还原蛋白底物溶液。 7.加人新鲜配制的溶解于少量（约0.2ml)烷基化缓冲液中的碘乙酸（最多与蛋白质底物等质量或者用少量的碘乙酸钠贮备液（每100ulO.lmol/LNaOH中溶入15mg碘乙酸），使其物质的量略大于混合物中-SH基团的数量（即蛋白质的-SH基团加上DTT)。 8.轻轻拍打管壁，混匀管中的内容物。 9.用氮气注满反应管，持续30s。 10.室温避光，孵育反应15min。 避光反应是为了防止碘乙酸分解产生碘离子。 11.加入稍过量的卜巯基乙醇（每5mgDTT约50ul），以去除多余的烷基化试剂，终止反应。 12.用浓盐酸调节溶液的pH为2~3滴0.5ul的反应混合物到pH试纸上，以检查溶液的pH。 我们推荐用小规模的实验来检验烷基化蛋白质的可溶性（由于蛋白质不同其溶解性会有显著差别）。可选用的易挥发的溶液和缓冲盐包括1mol/L乙酸（pH2.1)，10g/LNH4HCO3(pH7.8)和0.2mol/LN-乙基吗啉乙酸缓冲液（pH8.0)。蛋白质可以通过冻干从这些溶液中提取。 三、S-羧甲基蛋白质的回收（脱盐）经还原和烷基化的蛋白质，可以在挥发性溶液（比如1mol/L乙酸）中析出，或从缓冲盐溶液（比如碳酸氢铵）中脱盐。可是这一方法费时（一般24h中需要换几次透析液），而且蛋白质损失较大。透析后的蛋白质可以通过冻干回收。 13.去掉多余的试剂，通过尺寸排阻层析，使蛋白质快速脱盐。 14.用冻干的方法，使还原和烷基化的蛋白质从1mol/L乙酸中回收，制成干粉。 |
