总蛋白质的检测

1.总蛋白质色度法染色

简便的目视检测、相对简单的使用及广大熟悉方法的用户基础群，使得考马斯亮蓝(CBB)—直是最普遍使用的总蛋白质凝胶染色剂。如需要比考马斯亮蓝染色更高的检测敏感度，那么银染法是可选择的色度方法。如果需要对切下的蛋白质进行质谱分析，则首选不会引入共价蛋白质修饰的染色方法。

总蛋白质的检测

1.总蛋白质色度法染色

简便的目视检测、相对简单的使用及广大熟悉方法的用户基础群，使得考马斯亮蓝(CBB)—直是最普遍使用的总蛋白质凝胶染色剂。如需要比考马斯亮蓝染色更高的检测敏感度，那么银染法是可选择的色度方法。如果需要对切下的蛋白质进行质谱分析，则首选不会引入共价蛋白质修饰的染色方法。

考马斯亮蓝染色

考马斯亮蓝R-250及其二甲基衍生物考马斯亮蓝0250均为三苯代甲焼二横酸盐染料，能将蛋白质条带染成亮蓝色。染色条带通过静电作用同质子化了的碱性氨基酸(赖氨酸、精氨酸和组氨酸)相互作用，并通过疏水作用与芳香族残基的疏水缔合。染料不与聚丙稀酰胺高亲和力结合，但却会渗透凝胶介质并与其低亲和力结合,因此需要脱色步骤，除非染液为胶体配方。通常采用考马斯亮蓝作为终点染色剂，其为固定和染色步骤提供
重要的灵活应变的时间。考马斯亮蓝染色剂是非共价且可逆的，并且不会干扰随后切+的蛋白质条带的质谱分析。

考马斯亮蓝R-250的染色在酸性乙醇条件下完成，用量为考马斯亮蓝R-250
0.025%〜0.10%(m/V染液）、30%〜50%(V/V)甲醇（或乙醇，不及甲醇常用）搭配7%〜10%(V/V)乙酸溶液。染料溶解后将溶液用Whatman1号滤纸过滤，产生稳定的组成。固定和染色通常在约10倍凝胶体积的溶液中完成，如标准的微型凝胶需要50mL。为追求最敏感和始终一致的结果，凝胶的固定和染色需要在同样的乙酸溶液中进行。在此条件下，凝胶发生收缩。在7%乙酸中脱色，减少乙醇可以使凝胶恢复完整大小。脱色通常需要几次溶液的更换，加人染料吸附纸或泡沫橡胶/塑料可加速脱色。

在完全分析考马斯亮蓝染色法后，可得知,胶体配方不利于染色剂有效进入胶体介质之中会特定结合在蛋白质带上，从而使定量可靠,灵敏度也越加接近上文所述标准考马斯亮蓝R-250染g法，使低背景的染色成为可能。用于胶体染色剂时，考马斯亮蓝250要优于考马斯亮蓝R-250。初始配方是将〇.1%考马斯亮蓝g_250溶解在2%(?w/v)
憐酸，6%〇n/V)硫酸铵中（Neuhoffetal.，1985)。一种改善的广泛使用的配方为，将10%(WV)硫酸铵溶解在2%WV)磷酸中，随后加入5%(m/V)考马斯亮蓝0250储备水溶液至终浓度为〇.l%(w/V);染色前需先加人甲醇至终浓度为20%(V/V)(Neuhoffetal.，1988)。添加甲醇可增加单分散染料的比例,会导致染色加快，条带明显，但一些背景色也会变明显;增加硫酸铵的浓度会驱使染料变成胶体状态。此外,更新的配方建议加大染料和磷酸浓度，即最终配方中应含有0.12%(m/V)染料、10%(OT/V)硫酸铵、10%(m.V)磷酸及20%(V/V)甲醇，所有成分形成单一的稳定溶液。制备时,需要依次在水中加入上述量的磷酸、硫酸铵及粉状染料，至终体积的80%，然后加人甲醇至终体积(Candianoetal.，2〇〇4)。胶体染料溶液不能过滤。

大部分商业渠道可获得的考马斯亮蓝染料配方，是在上述各种配方和方案的基础上衍生而来的。

关于固定的建议众多，在电泳后用水清洗凝胶以除去染料溶液中的多数SDS,清洗时间可以是几小时至过夜,该简单程序有助于观察到良好的结果。蛋白质条带在几分钟内就可以观察到,背景起初澄清,最后呈淡蓝色。染色之后用水清洗凝胶以减弱背景。最近有一个简单实用的考马斯亮蓝染色方案的总结，包括一种「热」考马斯亮蓝染色方案，即在90°C用基于乙酸的考马斯亮蓝R-250染液配方染色;或是一种「快速」的5(TC下基于三氯乙酸的考马斯亮蓝〇——250胶体染料的方案。可由商业渠道获得的一
些方案还包括利用简单的基于微波炉加热的方案来加速考马斯亮蓝0250胶体染料的染色(和脱色）。

银染法

人们普遍认为银染法是其他所有超灵敏的染色方法的标准，是最复杂和可变的蛋白质凝胶染色方法学，已有好几十个已出版的方案，所有的方案都需要若干个阶梯式的步骤;蛋白质检测的基础是将与蛋白质相结合的银离子还原成金属银，或者如较少情况下在某些方案中出现的，造成局部的硫化银沉淀。银染法可以作为极限检测灵敏度的严格标准，而定量不是一个简单的任务，它取决于显色步骤的复合物的性质和不同蛋白质间的银信号灵敏度的差异。有商业渠道可获得的银染试剂盒，试剂盒采用各种文献中的经过验
证的方案和试剂混合物，能够为初次使用者提供可重复的结果。对于那些想要改进和优化用于常规内部使用的「自制」银染试剂和方案的人来说，这也是一种重要的学习和基准确立工具。Merril(1990)、RabiUoud(1990)和Poland等(2005)修订和总结了银染法的原
理、方法及方案。

关键步骤通常如下所述。

(1)固定凝胶，以固定蛋白质条带，并移除凝胶中的干扰物质,如SDS、缓冲液和盐，这些物质会结合银并造成背景染色。

(2)用能够结合蛋白质并提高银结合能力的物质,或是能够干扰剩余未结合的银造成的背景染色的物质来孵育凝胶。总之，这些各种各样的方法都和敏化作用有关。

(3)银离子浸泡处理凝胶。

(4)结合的银离子还原成不溶且可见的金属银，便出现了有色度的银染信号。

(5)终止显色过程，以防止凝胶介质中的背景染色遮掩住蛋白质条带。后两个步骤对时间的依赖导致了技术的复杂性,步骤(2)〜(4)中几次需要一定时间的清洗步骤也是如此。

银染法在银试剂和相应显影条件的基础上明显存在区别。碱性法将碱性环境下一种银的二元胺复合物作为银试剂,并在酸性甲醛溶液中显影;酸性法将弱酸性硝酸银作为银试剂，并在碱性甲酸溶液中显影。酸性染色法最近变得更受欢迎，因为它相对于碱性法降低了成本，并且背景染色也更容易控制。

目前有很多增敏剂。芳香族横酸盐(如二磺酸萘或磺基水杨酸)能结合蛋白质，也能结合银;剩余的与蛋白质结合的SDS也可以加强银的结合力。同样的，已被考马斯亮蓝染色的凝胶，如果再进行银染，同样可以提髙银染的强度。戊二醛作为增敏剂得以广泛使用,其原理在于引入了还原性醛基，能同蛋白质中的自由氨基相结合。硫化试剂，如连四硫酸盐或硫代硫酸盐能在蛋白质附近引入自由S2-，该离子会立即与银离子反应并形成不溶的硫化银。

因为在固定和增敏过程中使用戊二醒会造成蛋白质修饰，故银染后进行的蛋白质质谱分析会有问题。那些能同质谱分析相兼容的方法都不使用戊二醛，而这可能会使敏感性相对降低。增敏步骤若依靠连四硫酸盐和硫代硫酸盐，显影步骤将会相应地延长。因此，若银染后需要质谱分析，可以先对胶体进行考马斯亮蓝染色，再进行无戊二醛的银染步骤，这是一种便捷的两步估算出蛋白质样品纯度的色度方法。

Zn²⁺反染法

在SDS-PAGE后，不依靠固定剂或有机染料，使用金属阳离子快速对蛋白质染色的方法有很多。Zn²⁺反染法利用的是蛋白质和蛋白质-SDS复合物结合及隔离环境中的Zn²⁺,而在此环境中咪唑和Zn²⁺之间因沉淀反应会产生咪唑锌(ZnIm2),并产生不透明的背景，同透明的蛋白质-SDSZn²⁺区域形成对比。该技术是一种非固定步骤,在随后预期的微量分析，如洗脱条带的生物分析或酶分析中很有帮助，并且能同质谱分析或微量测序方法相兼容。该染色法迅速快捷，但检测灵敏度低于考马斯亮蓝染色法。

用于Imm厚度的凝胶的Zn²⁺快速反染法步骤如下所述。

(1)电泳之后，将凝胶浸泡在〇.2mol/L咪唑、0.1%SDS中15min。

(2)弃去咪唑溶液，再将凝胶浸泡人〇.3mol/L硫酸锌孵育30〜45s显影。

(3)弃去上述显影液，用水清洗凝胶若干次，每次Imin。

(4)将凝胶保存在0.5%(m/V)碳酸钠中。显影过度会有问题，但是可以通过将凝胶泡在1〇0mm〇l/L甘氨酸以溶解过量的ZnIm2来解决。尽管不透明背景下的透明蛋白质条带没有像考马斯亮蓝染色法或银染法那样有明显的颜色对比，但是可以在黑色背景下照明凝胶成像（Fernandez-Patron，2005;
Fernandez-Patronetal.，1998)

2.总蛋白质荧光法染色

荧光染色法结合了检测灵敏度(可与银染法媲美)与染色流程简便性(与考马斯亮蓝染色或Zn²⁺反染法相同），且其线性定量范围较比色法大10〜100倍。检测依赖于仪器,需要一个单色激发光源、能将波长较长的发射光从波长较短(也更亮）的激发光中分离出来的选择性光学滤镜以及一个检测模块。对于许多荧光染料，可通过目视检测，但是其灵
敏度不及采用摄像或仪器的方法。任何荧光染料都会带来一定程度的光漂白,这是曝光的结果。许多市面上可购买的荧光染料已得到改进，光稳定性相对较好。尽管如此，在目测和图像采集前,仍要小心避免将凝胶过久暴露于的外界强光之下。本章讨论的荧光染色法和染料的激发与发射的极限值在表31.1中呈列。通常，光激发和发射的颜色经常以大类区分，即紫外线（UV)250〜400nm;蓝光400〜500nm;绿光500〜550nm;黄光/橙光550〜580nm;红光580〜650mn;近红外线650〜850nm。这也是下面讨论的目的。

荧光染料通常可分为两类:在蛋白质条带部位表现出显著加强荧光效果的荧光染料和特异地结合蛋白质条带而不与凝胶基质结合的自发荧光染料。最早商品化的总蛋白质荧光染料，SYPROOrange和SYPRORed凝胶染料于19世纪90年代出现。这些染料最初是用于凝胶中染色DNA的常规荧光检测,其检测方法是，先经300nm紫外线透射，随后进行宝利来一步摄影(Polaroidphotography)。开发上述商品化突光染料的目的是建立类似于溴化乙淀或SYBRGreenDNA染色法一种简单的、一步式的总蛋白质特异染色和记录的工作流程，并且具有超越考马斯亮蓝染色方法的检测灵敏度。总蛋白质染料进一步的发展，产生了一些检测灵敏度范围近似于甚至超越了银染法的商业产品或配方。那些不需要在电泳前为样品加上共价标签的荧光凝胶染色法，与之后洗脱蛋白质条带的质谱分析相兼容。

尼罗红蛋白质凝胶染色剂

尼罗红(Nilered)是一种吩囉嗪酮类染料,当其从水转入到疏水环境，如SDS微粒或蛋白质-SDS复合物中时，便显示出强烈的荧光增强作用。尼罗红不会与SDS单体发生显著作用》利用这一特点开发出了一种适合SDS凝胶的迅速的不用固定的总蛋白质染色法。该方案要求电泳在非标准条件下进行，即电泳缓冲液SDS含量为0.05%(m/V)，要低于去污剂的临界胶束浓度，而不是通常应用于一维和二维SDS-PAGE的0.1%(m/v)的SDS含量。蛋白质样品制备要符合规格(Garnn,1990a;1990b)，如此SDS-蛋白质复合物在电泳时才会保持稳定,蛋白质条带的迁移也被认为是正常的。这种方法简单快速:将尼罗红储备液(0.4mg/mL保存在DMSO中）在水中稀释200倍，至终浓度为2ug/mL,每块凝胶加人超过10倍胶体积的染液(如一块5mL的微型凝胶需要50mL染色液)并立即充分搅动。染料在水中会快速地沉淀，故最理想的染色应该为2〜5min，超过这个时间效果也不会增强。染色之后,用水简单地清洗凝胶。可用紫外线或绿光光源激发,蛋白质条带会出现淡红色。本法检测灵敏度与考马斯亮蓝染色法相似。因为没有固定，尼罗红染色的凝胶在随后电泳印迹转移时有较好的转移效率（Daban，2001;Dabanetal.,1991)。染料的沉淀会在凝胶介质中形成高荧光背景，并且染料对SDS胶团的亲和性加上染料的不溶性使得该方法不能用于电泳缓冲液中含0•1%SDS的SDS^PAGE。染料的光稳定性也存在问题。

SYPROOrange、SYPR〇Red和SYPRO
Tangerine蛋白质凝胶染色剂

SYPRORed和SYPROOrange蛋白质凝胶染色剂是由Steinberg等(1996a;1996b)和Haugland等(I”7)描述的，SYPROTangerme蛋白质凝胶染色剂是由Steinberg等(2000b)和Yue等(2003)描述的，所有这三种染色剂也同样经Steinberg等（2005)讨论过。这些染色剂含有一个亲水官能团、一个芳香族的荧光团及一个脂肪族尾部，使染料既具有良好的水溶性，又具有很强的插人蛋白质-SDS复合物、SDS微粒或膜的能力,非极性环境下还有强烈的荧光增强作用。这些特征，再加上良好的化学和光学稳定性，可使染料以简便多样的染色步骤通用于标准缓冲液条件(〇.1%SDS)SDS——PAGE后的染色，其检测敏感度超越了胶体考马斯亮蓝0250染料。非标准缓冲液条件下(0.05%SDS)，这些
染料与尼罗红相比染色敏感度可增加4倍,但这对它们的使用不是必需的。

SYPROOrange和SYPRORed为受专利保护的磺丙基氨基氨基苯乙烯基（sulfopropylaminostyryl)染料，在市面上可以买到，其规格为溶解于DMSO中的10mmol/L储备液。染色方法很简单:①SDS-PAGE后，将凝胶放在染色液里;②图像采集之前,用水简单清洗凝胶。

制备染色液时,在乙酸[标准为7%(V/V)，2%〜10%都有同样效果]中将染料稀释5000倍至2umol/L。染色液通常需要现配，但也能稳定保存数月。电泳之后将凝胶放在凝胶体积10〜20倍(一块5mL的微型凝胶对应50〜100mL)的染色液中，染色液放在聚丙烯或聚碳酸酯碟中并持续温和地搅拌。将装有凝胶的染色液碟置于紫外线灯箱或
蓝光透照仪中可定期监控染色情况,还可以通过手持式紫外线灯或蓝光LED监测染色情况。通常对于10ug的细胞裂解物，在荧光背景下10min或15min就可以看到大量蛋白质的荧光条带。随着染色过程进行，蛋白质条带信号增加，而背景减弱、丰度较小的蛋白质的条带也变得更明显。对于Imm厚的凝胶，染色可以在Ih内完成，且凝胶在染色液
中放置数日都是稳定的。蛋白质-SDS-染料复合物在稀释的乙酸中是稳定的,但剩余的SDS会从凝胶中扩散出来,造成弱背景现象。因此应该最小限度地脱色。图像采集之前，需要用水清洗凝胶以移除凝胶表面的剩余染料、SDS和乙酸，清洗时水需要更换两次，每次清洗需要2〜3min。

SYPROTangerine蛋白质凝胶染料为一种受专利保护的昨哩基乙稀基（carbazolylvinyl)染料，根据推荐的染料稀释液和预期用途，可将其与SYPROOrange和SYPRORed蛋白质凝胶染色剂区分开来。这种蛋白质染料可在中性pH缓冲液(50mmol/L鱗酸盐、150mmol,‘LNaCl,pH7.0)中使用，此时蛋白质条带不会被固定，而且随后可进行酶谱分析、洗脱、复性，从而用于分析其离体活性或电转印迹。商业渠道获得的染料为10mmol/L的储备液;染色液由此稀释5000倍至2um〇l/L,现用现配。染色过程与SYPROOrange相同，Ih内可完成;图像采集之前用水清洗凝胶。利用紫外线光源或蓝光光源来完成光谱激发。

SYPRORuby蛋白质凝胶染色剂和其他基于钌的配方

诸如SYPRORuby蛋白质凝胶染色剂这样的用于检测凝胶中或印迹上的蛋白质的基于有机金属钌离子的发光染色剂，可以用简单的终点染色法步骤，提供与银染法相媲美，甚至超越银染法的荧光检测敏感度，还被引入SDS——PAGE后(Berggrenetal.,2000)或等电聚焦电泳后(Steinbergetal.2000a)的即用型染色液配方中。这些染料的发展与配方是以胶体考马斯亮蓝染色方案为基础，其中的有机组分螯合发光的钌(II)，并且以同考马斯亮蓝染色法类似的方式为非共价蛋白质提供了基础，即首先与碱性氨基酸发生离子作用，其次再发生疏水作用。（4,7-二苯基-1，10-菲绕啉酯）钌[rutheniumIItris
(bathophenanthrolinedisulfonate)]制备、染色方案及与SYPRORuby蛋白质凝胶染色法的比较的详细说明告诉我们，SYPRORuby的染色原理与钌染色法很相似;质谱分析反映出二者的一些微小差异，这些差异是由它们专有的化学性质引起的。随后SYPRO
Ruby凝胶染色剂得到改进，最初配方的性能得到提升,成为了一种适用于SDS——PAGE和等电聚焦凝胶的即用型染色液(Berggrenetal,,2002)。因此SYPRORuby与钌染色法的不同之处不仅在于突光化学方面，更重要的在于染色液配方方面,即其拥有稳定的即用
型染色液和相对简单的染色方案。

⑴用50%(V/V)甲醇、10%0VV)乙酸固定凝胶，固定时间为30min至过夜。

(2)凝胶用SYPRORuby染料染色。这是一种终点染色法，染色3h至过夜，性质稳定。

(3)用10%〇//V)甲醇、7%(V/V)乙酸进行简单的凝胶脱色。

利用基于微波炉的方案可以加快染色过程的进行。SYPRORuby蛋白质凝胶染料具有相对较高的消光系数和量子产率，因此它十分亮眼,化学稳定性和光稳定性都很高。光谱的激发可借助紫外线或是蓝光光源;蛋白质带目测呈橘红色。荧光蛋白质染色的机制在于该染料与蛋白质条带和凝胶介质结合的差异性,凝胶介质不与染料结合。因此蛋白染色剂本身是不具荧光性的。SYPRORuby蛋白质凝胶染料亮度大、稳定性高、检测灵敏度强且便于使用，加上其蛋白质组应用的文献之多以及积极的市场营销攻势，该产品
为其后蛋白质凝胶染色剂的发展提供了比较标准，正如银染法仍然是检测灵敏度的比较基准一样。

Epicocconone蛋白质凝胶染色剂：DeepPurple和LightingFast蛋白质凝胶染色剂

Epicocconone蛋白质凝胶染色剂是种从真菌黑附球菌(EpicoccMOTTiignwn)中提取的荧光团，用于总蛋白质染色试剂盒中。该染料被冠以了多种商品名称，包括DeepPurple和LightingFast总蛋白质凝胶染料，方案各异。下面是一种方案。

(1)将SDS-PAGE凝胶在7.5%(V/V)的乙酸中固定1h。

(2)用水清洗凝胶(2X30min)。

(3)荧光团储备液在水溶液中稀释后,将凝胶在该水溶液中染色Ih。

⑷将凝胶在0.05%(V/V)的氨水中孵育(3X10min);

(5)立即捕捉影像，可用紫外线、可见蓝光或可见绿光激发。

该染色剂的灵敏度可与SYPRORuby蛋白质凝胶染料相媲美，或者较之更好（BellandKaruso，2003;Mackintoshetal.，20〇3)。染色是可逆的，并与质谱分析兼容。暗红色的信号并非特别显著，其灵敏度完全取决于染色剂的荧光特性,因此背景较弱。该染色方法似乎需要痕量的在乙酸固定后仍然与蛋白质形成复合物的SDS。这种染色剂在水中仅发出微弱的荧光(绿色），但是在经SDS处理的蛋白质存在的情况下，荧光增强并发生红移。Epicocconone蛋白质凝胶染料已被证实能与赖氨酸反应，形成可被碱水解的荧光加合物，因此产生突光并使得染色具有可逆性(Coghlanetal.,2005)。浓缩的染色储备液必须冷冻保存，在使用前解冻。考虑到稳定性因素，影像捕捉应该在染色结束后立即进行。

荧光素衍生物

含有烃类尾部的荧光素衍生物是很有效的蛋白质凝胶染色剂。将5-十二酰基氨基-(C12-FL)、5-十六酰基氨基-(C16-FL)及5-十八酰基氨基-奕光素-(C18-FL)用于一些类同于经典考马斯亮蓝R-250染色法的样品染色方案中，可证明该染色剂敏感度比得上银染法。最有效的荧光团为C16-FL。例如，凝胶染色时染液为30%(V/V)乙醇、7.5%(v/v)乙酸、1umol/L染料,染液更换两次。再用水清洗，水也要更换两次，最后用7.5%乙酸脱色。染色剂具焚光性，易知其基本原理是同结合在复合蛋白质中的残余SDS相结合;可兼容质谱分析(KangetaL，2003)。荧光素的光谱激发和发射分别由蓝光和绿光完成。

Krypton蛋白质凝胶染色剂

Krypton蛋白质凝胶染色剂是受专利保护的轻基喹啉(hydroxyquinoline)类染料配方，激发光谱为绿色，突光显色为橙色(Wolfetal.,2007)。KryptonInfrared蛋白质凝胶
染色剂含受专利保护的香豆素/氟喹诺酮和/或玛蒂娜(Martina)型染料,激发光谱为红光/近红外线，发射光谱为近红外线(Czemeyetal.,2008)。可以买到这些产品的10X的组分并需要先稀释成可用的溶液。这些产品在检测灵敏度和动态线性范围方面同SYPRORuby和De印Purple蛋白质凝胶染色剂相当。染色方案依照标准的固定-染色-快速脱色的工作流程，并在快速染色方面得到改进,因此整个染色过程可在1〜4h完成；若要追求最高灵敏度和信号线性度,可以延长此方案的时间。这些染色剂均可以和质谱分析兼容使用。

Flamingo蛋白质凝胶染色剂

Flamingo蛋白质凝胶染色剂是受专利保护的基于香豆素的花青染料配方（Berkelman，2006)。该染色方案需要在染色前完成固定。可以买到的染料为IOX的储备液，使用前用水稀释即可。当染料与蛋白质结合时表现出荧光增强作用。该染色剂背景较弱，报道称短脱色步骤可使背景进一步减弱。激发光谱在绿光范围内,信号为橙色/红色。该染色剂被认为与银染和SYPRORuby相当，并且也可以兼容质谱分析。

LUCY蛋白质凝胶染色剂

LUCY蛋白质凝胶染色剂是受专利保护的三甲川花青(trimethinecyanine)染料配方,在SDS/蛋白质混合物中表现出荧光增强作用。染色通常在稀释的乙酸中进行，方法与SYPROOrange—样。据报道该染色剂也能与质谱分析兼容(Kovalskaetal.,2006)。

3.预电泳样品标记

琥珀醜亚胺酯是一种用于电泳前蛋白质样品的共价氨基标记的电荷平衡的花青染料(Cydye)，它的研发和使用已成为荧光二维差异凝胶电泳（2-DDIGE,—种非常重要的蛋白质组技术）的基础（Mindenetal.,2002;Tongeetal.,2001;WaggoneretaL,1993)。DIGE在第30章中有更详细的讨论。有许多荧光复合物的琥珀酰亚胺酯以及其他能反应的荧光共价蛋白质标记物也同样被广泛使用（Haugland，2005)s如今拥有了广泛的仪器基础，对任何荧光标记的蛋白质制备物组分进行凝胶分析已是常规步骤。

磷蛋白的检测

作为基本的细胞信号机制,指定氨基酸残基的可逆磷酸化作用的重要性已无需争辩。当前磷蛋白染料具有受专利保护的构型，即磷酸基结合部分共价连接于荧光团。检测的方式是选择性结合磷酸化的氨基酸，但是没有荧光增强作用。从某种程度上讲,许多可溶的荧光复合物都可作为总蛋白质染色剂。一种选择性磷蛋白染料需要含有一个磷酸基结合部分、一个对总蛋白质的自发突光很低的荧光团、一种可抑制非特异性总蛋白质染色的组分及一个促进残余的非特异染色解离的脱色方案。每个多肽中与总蛋白质染色剂靶定
的氨基酸数量相比，靶定的磷酸基仅有少数。磷蛋白检测敏感性通常和用胶体考马斯染色剂或SYPROOrange染色剂进行总蛋白质检测时处于同一水平，而不及银染剂或SYPRORuby染色剂那么敏感。凝胶中蛋白质磷酸化检测需要有适当的对照，包括展示已知的磷酸化状态（阳性对照)或去磷酸化状态（阴性对照）的蛋白质,并且如果可以的话，还需有用活性憐酸酶对样品进行处理的对照。在检测到磷蛋白信号后，需要用一种总蛋白质染色剂对凝胶进行染色。市面上可以买到的磷蛋白染色剂可与随后的考马斯亮蓝染色剂、银染剂或总荧光染色剂(如SYPRORuby)兼容,但不能与依赖SDS的荧光染色剂(如SYPROOrange)兼容。磷蛋白染料可与随后的分析步骤，如质谱分析或肽测序相兼容。

1.Pro-QDiamond嶙蛋白凝胶染色剂

Pro-QDiamond磷蛋白凝胶染色剂（LifeTechnologies)系一种即用型配方，是根据磷酸肽(phosphop印tide)固定金属亲和层析的原理发明的，利用的是溶液中荧光团连接的金属螯合部分，这种溶液含金属离子、盐和可与水混溶的有机溶剂，用缓冲液调pH至4(AgneWetal.，2006)。这种染色方案需要在甲醇/乙酸溶液中固定，用水清洗以去除固定剂，用Pro-QDiamond配方进行染色，随后在含1,2-丙二醇混合物中脱色，在乙腈中脱色效率更高[如50mmol/L乙酸钠(PH4)、15%〜20%1,2-丙二醇或15%〜20%乙腈]。微型凝胶中的磷蛋白检测需至少1〜2ng的丨酪蛋白（一种五磷酸化蛋白质)或8ng胃蛋白酶(一种单憐酸化蛋白质），该检测法具有1000倍的线性动态检测范围。总蛋白质染色后，再使用Pro-QDiamond染色剂可得知蛋白质的体外磷酸化状态或去磷酸化状态。

2.Phos-tag磷蛋白染色剂

可以买到Phos-tag磷蛋白染色剂(PerkinElmer)的试剂盒包装,其采用与Pro-QDiamond染色剂相同的通用染色策略，却有与之不同的缓冲液组分。这些染色剂含有已有充分描述的Phos-tag结合部分，g卩醇盐-桥的双核锌(II)配合物。该分子是根据可逆的磷酸锌(II)配合物的酶学原理设计的。解离常量为25nmol/L的Phos-tag苯基磷酸盐复合物与其他磷酸基结合部分的微摩尔解离常量的对比已有描述（Kinoshitaetal.,2004;KoikeetaL，2007)。在某些情况下,Phos-tag技术对基于凝胶的磷蛋白分析比直接胶内憐蛋白染色更有效(Kinoshitaetal.，2006;Yamadaetal.，2007)。可买到的Phos-tag凝胶染色剂试剂盒，可以选择双荧光，最大激发光谱为：Phos-tag磷蛋白凝胶染色剂300nm/460nm(双激发最大值)或540nm。近期报道称，使用Phos-tag300/460染色剂来检测一种具细菌性应答调节子的天冬氨酸磷酸化(BarHeriandStock，2008)。

糖蛋白的检测

1.通用糖蛋白检测

糖基化是真核细胞中最常见的蛋白质翻译后修饰。寡糖通常连接于天冬酰胺侧链(iV-连接糖基化)或丝氨酸和苏氨酸羟基侧链(〇连接糖基化）。凝胶中蛋白质电泳后染色时，通常先用高碘酸氧化邻近的糖基，然后根据希夫碱机制进行酰肼结合。

显色：酸性品红染色剂

市面上可以买到的试剂盒都是基于一种利用酸性品红染色剂（Zzchariusetal.，1969)的显色方法，包括Gelcode(ThermoScientific)和Glyco-Pro(Sigma-Aldricli)糖蛋白染色试剂盒。凝胶在50%甲醇中固定、清洗，并在1%高碘酸盐中孵育从而氧化邻近的糖基，再清洗，用品红亚硫酸盐试剂孵育，在还原剂(偏亚硫酸氢钠或硼氢化钠）中孵育，清洗，再保存在稀乙酸中。糖蛋白指示通过品红条带完成，品红条带在染色反应进行时开始出现，随后显色缓慢增强。

荧光通用糖蛋白染色剂

Pro-QEmerald300和Pro-QEmerald488糖蛋白凝胶染色试剂盒（LifeTechnologies;数字表示各自的常用激发光源）、Krypton糖蛋白染色试剂盒（ThermoScientificPierce)和GlycoprofileIII荧光糖蛋白染色试剂盒（Sigma-Aldrich)均是利用高碘酸盐氧
化后与荧光酰肼结合而进行染色。使用这些试剂盒时,不需要进行后续的还原反应(如和偏亚硫酸氢钠进行还原反应）。

大多数可买到的荧光酰肼都有自发荧光。亮绿荧光的Pro-QEmerald300酰肼试剂在溶液中不显荧光,在同小分子醛结合时就显弱荧光性。染色后的糖蛋白条带是亮绿色的，结合后的染料可作为成核位点使溶液中浓度接近饱和的自由试剂沉淀（Hauglandetal.，2005)。Pro-QEmerald300和Pro-QEmerald488糖蛋白染料试剂盒的使用已有—些细节方面的讨论（Hartetal.，2003;SteinbergetaL,2001)。这些研究发现了Pro-QEmerald300糖蛋白染料是最灵敏的选择性糖蛋白染料，在使用时却只适用于紫外线光源。研究中的数据和观察结果都突出表明，许多荧光酰肼会显示总蛋白质的非特异染色。此外，染料稀释液组分也会影响其选择性。通过选择那些已经充分了解其特性的蛋白质
和/或通过糖苷酶消化后的样品，以此作为含有蛋白质的已知糖基化状态的对照，在待测样品电泳时将其作为对照泳道是很有帮助的。未经高碘酸盐氧化的平行胶也许可以指示固有的非特异蛋白质染色，或是由于其他氧化反应而造成的内源醛或酮的染色。最后需要注意的是，通过突光扫描仪可以检测出酸性品红亚硫酸盐染色的蛋白质条带。扫描仪
需532nm激光和675nm长通过滤镜，比起可见的色度法极限，其敏感度增加2〜4倍。

2.O型N-乙酰氨基葡萄糖的检测

叠氣化物-炔烃”点击化学“试剂

许多蛋白质经N-乙酰氨基葡萄糖(OGlcNAc)以P-连接方式O型连接到丝氨酸和苏氨酸残基上，从而获得显著的修饰。这种翻译后修饰体现了可控方式下磷酸化作用的位点特异的相互性。因此OOlcNAc糖基化可能扮演一种动态「阴-阳」角色，介导磷酸化调节的信号，以及其他特异的蛋白质信号(GolksandGuerini，2008;Hart，1999)。从历史上看，基于凝胶的OGlcNAc检测仍有一定问题，但如今已经可以实现用于凝胶检测的敏感的OGlcNAc特异荧光标记。

这一方法是基于铜(I)催化的叠氮化物和炔烃间的Huisgen[3+2]环加成反应，是一种「点击化学」反应（Agnewetal.，2〇08;Clarketal.,2008)。蛋白质（于纯化的任意阶段)经Click-iTOGlcNAc酶标系统(LifeTechnologies)酶促标记(4〇C过夜），这种标记使用的是一种允许条件下的突变型浐I，4-半乳糖基转移酶(Gal-TlY289L)，这种酶可以将UDP-半乳糖中的叠氮化物修饰的半乳糖(GaINAz)转移到目标蛋白质的〇型JV-乙酰氨基葡萄糖残基上（RamakrishnanandQasba,2〇〇2)。叠氮化物修饰的OGIcNAc糖基化的蛋白质随后经铜(I)催化的点击反应被荧光标记，该反应使用的是四甲基罗丹明-炔烃(TAMRA-alkyne)或Dapoxyl炔烃染料，染料各自为CUck-ItTAMRA或Click-iTDapoxyl蛋白质分析检测试剂盒（LifeTechnologies)中的催化试剂。被标记的蛋白质经SDS-PAGE被分离,再通过适当仪器进行图像采集。酶标试剂盒含有一种阳性对照蛋白质w晶型。该技术已被证明可利用TAMAR炔烃检测试剂来检测微型凝胶中的1〇〜40umol的OGIcNAc，并且可与下游的质谱分析相兼容。被标记的蛋白质同样可以用总蛋白质染色剂或其他翻译后修饰—特异的染色剂（如Pro-QDiamond磷蛋白染色剂或
Pro——QEmerald300糖蛋白染色剂)染色。