| 实验方法原理 | 差异去垢剂分离法（differentialdetergentfractionation,DDF)包括使用一系列含不同去垢剂的PIPES缓冲液对细胞进行连续抽提，首先是毛地黄皂苷，其次是Triton,最后是Tween/脱氧胆酸盐。这些步骤产生4种在生化和电泳上相异的组分(见图3.3和表3.7)。包括： 1.胞质蛋白和可抽提的细胞骨架组分。用镁沉淀的方法可以从这个组分中初步纯化出微管组分（见本方案的附加方案：用镁沉淀微管蛋白和微管结合蛋白）。 2.膜和细胞器蛋白。使用TritonX-114可以富集完整的膜蛋白（Bordier，1981;PrydeandPhillips,1996)。 3.核膜蛋白和可抽提的核蛋白。 4.抗去垢剂的细胞骨架纤维和核基质蛋白。骨架结合蛋白及其相互作用可进一步用不同浓度的脲来抽提、分析。 此处所述的DDF方案改自分离MADIn-Darby犬肾（Madin-Darbycaninekidney,MDCK)细胞组分的方法（Fey,etal,1984)。其中的改动包括增加毛地黄皂苷提取步骤，在毛地黄皂苷和Triton缓冲液中加入EDTA，并去掉了核酸酶消化步骤（在有SDS的存在下，DNA被强力变性）。总RNA也可以用常规方法从每个变性组分中分离，并进行Northern杂交分析来观察mRNA的动态（见附加方案：去垢剂提取物中RNA的分离）。该方案和附加方案均由MelindaRamsby和GregoryMakowski(UniversityofConnecticutHealthCenter)友情提供。 | ||||||
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| 实验材料 | 悬浮或单层细胞培养物 试剂、试剂盒 | 丙酮去垢剂提取缓冲液细胞骨架溶解缓冲液lXO’Farrel裂解缓冲液lOXO’Farrel裂解缓冲液磷酸盐缓冲液10XPIPES缓冲液台盼蓝脲（固体） 仪器、耗材 | 离心机（冰冻）匀浆器聚四氟乙烯包被的玻璃面冰冻干燥器台式混合器 实验步骤 | 一、细胞制备1.在冰上预冷细胞培养物，然后用冰浴的盐溶液、PBS或其他的非变性缓冲液洗2~3次。 保存1份洗涤缓冲液（贮存在-70°C)以备将来进行样品校正，或用于酶、蛋白或RNA分析的对照材料。 2.选择下面合适的方法来处理悬浮液或单层培养物。 处理悬浮培养物：悬浮培养的细胞所需的DDF体积取决于细胞的湿重或细胞数量。 （1）转移一小管悬浮培养物到已称重的塑料小管中，然后短暂地离心； （2）倒出培养基，并称出细胞沉淀的湿重； （3）进行第二部分的第1步。 处理单层培养物：单层培养物所需DDF的体积取决于培养细胞的平面区域的大小或细胞数量。 （1）测出培养瓶或培养皿的表面积，或是计算一个有代表性的培养皿中细胞的数目； （2）进行第三部分的第1步。 二、悬浮细胞的去垢剂分离通过连续地加入和去除DDF缓冲液来操作DDF，所有的提取过程都是在冰上进行，并温和地搅动。注意提取次数对重复性是很重要的。提取物在用于实验前应一直放在冰上，或冰冻保存（最好是一70°C)。测出每一种去垢剂提取物的回收体积，并计算净产量或分布百分比。每一种DDF缓冲液，都应保存一小管，以备将来进行样品校正，或用于实验的对照材料。 1.每克（湿重）洗过的细胞沉淀中加入5倍体积冰冷的毛地黄皂苷提取液缓冲液。温和地旋转，重悬细胞沉淀。 2.冰浴条件下在台式混合器上温和地晃动，直到被通透化（permeABIlized)的细胞达95%~100%(约IOmin)(用台盼蓝染色排除法估计）。
3.480g离心提取混合物10min。 4.转移上清到另一干净的试管中。测定上清（胞质组分）的体积后，把胞质组分分装到几个小管中，并把它们存在一7℃条件下。此为CYTO组分（见图3.3和表3.7)。 5.用5倍沉淀体积（相对于细胞沉淀的最初重量[由第一部分第2步所决定])的冰浴TritonX-IOO提取缓冲液仔细地重悬毛地黄皂苷不溶的沉淀，以获得均一的悬浮液。 在DDF这一方案中，TritonX-114可以替代TritonX-100，双向凝胶电泳分析提取组分的结果表明二者没有明显的区别。相对于TritonX-100,TritonX-IU具有更低的熔点（TritonX-100熔点为60°C;TritonX-114熔点为20°C)，并在非变性温度下可以将样品分为高脂相（lipid-richphase)和低脂相（lipid-poorphase),因而可以对膜整合蛋白和膜外周蛋白，以及可溶的细胞器内含物进行亚组分分离。 6.冰浴条件下在台式混合器上温和地晃动细胞30min。 7.5000g离心提取混合物10min。 8.转移上清液至另一个干净试管中，测量上清液（膜、细胞器组分）的体积，分装后在一70°C条件下贮存。此为MO组分（见图3.3和表3.7)。 9.Triton提取残渣用Tween-40/脱氧胆酸钠提取缓冲液重新悬浮，其体积为Triton提取（第⑤步）时所用体积的1.5倍。使用特氟隆（Teflon)滑壁玻璃匀浆器(smooth-walledglasshomogenizer)，以中等速度研磨介质5次，使沉淀重新悬浮。 10.6780g离心抽提混合物10min。 11.转移上清液至另一个干净试管中，测量上清液（核组分）的体积，分装核组分后于一70°C条件下贮存。此为NUC组分（见图3.3和表3.7)。 12.将含有1.2mmol/LPMSF的冰浴PBS(pH7.4)加到抗去垢剂沉淀中，使用Teflon研磨3次以重悬沉淀，然后12000g离心1Omin,收集沉淀。 13.重复步骤12两次以上，以彻底清洗沉淀。 14.去上清，用90%丙酮（一20°C预冷）洗沉淀一次。 15.过夜冻干沉淀（细胞骨架/核基质组分）。 16.在已知重量的离心管中测出沉淀的重量，于一70°C条件下贮存样品。此为CSK/MAT组分（见图3.3和表3.7)。 通常情况下细胞悬浮液的CSK/MAT组分的产率很高。因而，贮存冷冻干燥的沉淀组分更为方便，用时只需用非变性的细胞骨架溶解缓冲液来重悬已测定过重量的沉淀。 17.进行第四部分的操作。 三、单层细胞培养物的去垢剂分离通过连续地加人和去除DDF缓冲液对DDF进行操作。所有的提取过程都是在冰上进行的，并温和地搅动。注意提取次数对重复性是重要的。实验前，提取物应维持冰浴，或冰冻保存（最好是-70℃)。测出每一组去垢剂提取物的回收体积，并计算净产量或分布的百分比。每一种DDF缓冲液要保存一小管以作随后的样品校准或作为实验的对照材料。 1.直接加1ml冰浴的毛地黄皂苷提取缓冲液到T-25培养瓶中的单层培养细胞上。 典型的T-25培养瓶能容纳约5X1O6个细胞。T-75培养瓶或100mm培养皿应加人3ml的毛地黄皂苷提取缓冲液。 2.冰浴条件下在台式混合器上温和地晃动细胞悬浮液，直到95%~100%的细胞被通透化（约1Omin)(用台盼蓝染色排除法[Trypanblueexclusion]检测）。
3.倾斜培养瓶，将液体（胞质组分）倒入一个小的培养會。残余溶液用吸管转移入培养管中。测定胞质组分的体积，分装后在一70°C条件下贮存。此为CYTO组分（见图3.3和表3.7)。 4.每个T-25培养瓶（约5X1O6个细胞）中加入1mlTriton提取缓冲液。 在DDF这一方案中，TritonX-114可以替代TritonX-100，双向凝胶电泳分析提取组分的结果表明二者没有明显的区别。相对于TritonX-100,TritonX-114具有更低的熔点（TritonX-100熔点为60°C;TritonX-114熔点为20°C),并在非变性温度下可以将样品分为高脂相（Hpid-richphase)和低脂相（lipul-poorphase),因而可以对膜整合蛋白和膜外周蛋白，以及可溶的细胞器内含物进行亚组分分离。 5.冰浴条件下在台式混合器上温和地晃动细胞30min。 6.倾斜培养瓶，将液体（膜和细胞器组分）到入一个小培养管中，残余溶液用吸管转移人培养管中。测定该组分的体积，分装后在一70°C条件下贮存。此为CYTO组分（见图3.3和表3.7)。 7.每个T-25培养瓶（约5XIO6个细胞）中加入0.5?I.0mlTween-40/脱氧胆酸钠提取缓冲液体来提取单层细胞。 8.倾斜培养瓶，将液体（核组分）到入一个小培养管中，残余溶液用吸管转移入培养管中。测定核组分的体积，分装后在一70°C条件下贮存。此为NUC组分（见图3.3和表3.7)。 9.用PBS在原位浸没单层细胞。 10.向培养瓶中加入1?3ml的无/3-巯基乙醇的非变性细胞骨架溶解缓冲液，对抗去垢剂残渣进行提取。倾晃培养瓶以悬浮残渣。测量体积（细胞骨架和基质组分），分装后在一70°C条件下贮存。此为CSK/MAT组分（见图3?3和表3?7)。 非变性细胞骨架溶解缓冲液的体积取决于细胞类型和培养时间（即胞外基质的量）。一般，1~3ml是合适的范围。 11.进行第四部分的操作。 四、蛋白浓度的测定1.在冰上融化去垢剂缓冲液和提取物。 2.用水稀释毛地黄皂苷/EDTA和Triton/EDTA提取物（对于悬浮培养物的提取物加入4倍体积的水，单层培养物的提取物中加人2~3倍体积的水）。Tween/DOC提取物则不用稀释。 3.在无β-巯基乙醇的细胞骨架溶解缓冲液中溶解冷冻干燥的CSK/MAT沉淀。每1Omg(干重）沉淀使用1ml缓冲液。如果需要可以对单层培养物的CSK/MAT进行稀释。 4.每个样品取20~50ul，用BCA方法（见附录2)测定，重复两次。 另一种测定蛋白质浓度的方法是Peterson的福林（Folin)-酸法(1983)，该方法对于去垢剂的干扰不敏感。建议不使用标准的Lowry方法，因为在实验中会有由垢剂诱导的凝聚发生（M.Ramsby，未发表）。 五、使用双向凝胶电泳分析蛋白质组分不同细胞类型的DDF样品可用于二维PAGE分析，包括IEF和非平衡pH梯度电泳（nonequilibriumpHgradientelectrophoresis,NEpHGE)。有关双向凝胶的例子，参见Ramsby等（1994)以及Ramsby和Makowski(1999)。新鲜的或融化的DDF提取物（置于冰上）首先要标准化，使蛋白含量相同，然后添加固体脲至终浓度9.5mol/L0 1.对于100ul的样品，加入85mg脲和15ul10xO’Fairell裂解缓冲液，加热至室温作用。 2.对于干燥的CSK提取物，可在IXO7FarreIl裂解缓冲液中直接溶解（O’Farrell，1975;O’Farrell，etal，1977)。 3.对于非还原SDS缓冲液中的CSK提取物，通过加入固体脲和加入1OXO’Farrell裂解缓冲液，至终浓度9.5mol/L。 加固体脲和1OXO’Farrell裂解缓冲液，以便尽可能地减少由稀释带来的影响，并尽可能地检测低丰度蛋白。稍微加热样品有利于脲的溶解，但是避免过热（增加温度/或延长加热时间），否则可能会导致人为的氨基甲酰化。 4.使用2D电泳分析DDF样品（有关方法参见O’Farrell，1975;1OXO’Farrell，etal，1977;或参见第4章）。 5.LEF凝胶（见第4章）含有3.5%两性电解质（2%对应PH5~8，1%对应pH3?10，0.5%对应pH2~5)，样品需要电泳9800V.h,其中在最后1个小时用800V聚焦（DuncanandHershey，1984;Ramsby,etal，1994)。 6.NEpHGE凝胶含有2%两性电解质（PH3~10)，样品需电泳2400V.h(Ramsby,etal，1994)。 通常在15~60沁的样品含量达到25~1OOyg的蛋白，就足以通过考马斯亮蓝或放射自显影观察到；低丰度蛋白可通过银染检测到。实验表明，样品中的去垢剂缓冲液的体积多少不会对IEF凝胶pH梯度的线性范围产生不利的影响。但是，含有Tween/DOC的样品可能引起向低pH的轻微漂移。 |
