| 实验步骤 |
材料生理盐水 弗氏完全佐剂（completeFreundsadjuvant，CFA)，Sigma公司 实验动物：无病原体大鼠、小鼠（推荐使用BALB/c小鼠）或仓鼠（推荐使用Cytogen研究所的美洲仓鼠） 弗氏不完全佐剂（incompleteFreundsadjuvant，IFA)，Sigma公司，可选用1〜2ml玻璃注射器（有Luer-Lok接头，已消毒） 三通管 IOOml烧杯 20G注射针头，已消毒 1.将2X106〜5X107个细胞或1〜50ug蛋白质或多肽置于生理盐水中制备成抗原。如果免疫原为细胞，在接种前将细胞于无血清培养基中清洗3次。在融合实验（见基本方案2)前至少3d准备好已免疫接种的实验动物（足够用于几次的融合）。 2.使用1〜2ml玻璃注射器（有Luer-Lok接头）吸取抗原，连接三通管。 3.完全混匀CFA以打散结核分枝杆菌。用另一支玻璃注射器吸取与抗原液等量的CFA并连接装有抗原的注射器（图1.2.1)。 4.将抗原液反复注入CFA再抽出直至稠化混合，制成乳状液。取50ml冷水置于IOOml烧杯中。挤出一滴乳状液滴于冷水表面以检测乳状液是否稳定。如果乳状液呈液滴状在水面聚集，则进入步骤5。如果液滴散开则继续混合操作直至稳定的乳状液形成。 5.将乳状液移入一个注射器，将另一个注射器和三通管移去。将已消毒的20G注射针头安装于注射器上以封闭乳状液。 6.麻醉大鼠（附录2D)，或固定小鼠或仓鼠（附录20。腹腔内注射乳状液，剂量为(附录2E):大鼠每只0.5〜lml、小鼠每只小于0.2ml、仓鼠每只0.2〜0.4ml。将针头插入皮肤并于皮肤与腹膜壁间穿行一段距离后，再刺入腹膜腔。避免用力压迫注射器的活塞以免过度的压力使针头与注射器分离，造成乳状液的喷溅。在拔出针头前转动针头以减少渗出。 7.于10〜14d后以大约相同剂量的抗原二次免疫动物。如果计划在免疫3d后进行细胞融合实验，则使用水相溶解的游离抗原或休眠期的完整细胞进行免疫。如果不立刻进行细胞融合，则应用IFA(不含有结核分枝杆菌）乳化的抗原进行免疫，而不使用CFA。 8.如果需要，可以于初次和二次免疫后的7〜IOd用ELISA(单元1.1)或免疫沉淀法(单元12.2)测定抗体滴度（单元1.2)。 |
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