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| 实验材料 | 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 试剂、试剂盒 | PP缓冲液变性裂解缓冲液 仪器、耗材 | 微量滴定板 实验步骤 | 3.1高通量蛋白的表达和纯化 我们用在PQE30表达载体里构建的，可表达带N端RGS-His6标记的大肠杆菌CDNA表达克隆来生产重组植物蛋白。由于超出本章节的范围，我们不在此详细叙述这种表达克隆的产生过程，只是简要地概括一下。从下列的cDNA表达库中，我们也许能获得以上所述的植物表达克隆：在表达载体PQE30NST(检索号：AF074376)中构建的大麦表达库和在pQE30NASTattB载体（检索号：AF386205)中构建的拟南芥表达库。这些表达库已经按照KonradBuessow研究小组的方法，用脱氧胸腺嘧啶脱氧寡核苷酸作引物，生产具有完整N端的重组蛋白[34~36]。我们用全长拟南芥克隆作为植物蛋白表达克隆的另一个来源，这个全长拟南芥克隆是通过用基因特异引物限制性依赖克隆，或用GATEWAY克隆技术重组依赖性克隆，进行可读框直接克隆获得的。 为了从上述这些资源中高通量和小规模表达植物蛋白质，我们采用如下方法。 蛋白质表达 (1)在孔体积为2ml的96孔深孔板上加满附加了2%葡萄糖，100μg/ml氨苄青霉素和15μg/ml卡那霉素的100μl2YT培养基。 (2)重组克隆培养物从之前保存在-80°C的384或96孔微孔板上接种出来，接种时要用96针复制器。 (3)培养物在37°C剧烈振摇（320r/min)生长16h后，加入900μl预先加热的培养基（1XSB培养基，附加了100μg/ml氨苄青霉素，15μg/ml卡那霉素，20μg/ml硫胺的1XPP缓冲液），然后继续培养2h。 (4)为了诱导蛋白质表达，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，并继续培养4~5h。 (5)4°C，1500g离心10min，收集细胞，沉淀物于-80°C下保存。 (6)取出一部分收获细胞的裂解产物在15%的聚丙烯酰胺凝胶上检测蛋白质表达效率（图28-1)。  蛋白质纯化 (1)首先，在解冻的沉淀物中加入150μl的变性裂解缓冲液，剧烈涡旋振荡溶解沉淀物，然后室温下振摇（约650r/min)孵育30min(见注释2)。 (2)1900g离心裂解细胞。上清液转移到96孔滤板上（见注释3)，并且用真空抽滤盒（vacuummanifold)迅速吸入到一新鲜滤板上（见注释4和注释5)。 (3)接着在每个孔中加入30μlNiNTA-琼脂糖（1:2稀释于裂解液中），用胶带密封，室温下，300r/min振摇1h，使组氨酸标记物与蛋白质结合。 (4)用100μl的洗涤缓冲液重悬、洗涤琼脂糖微球，振摇5min，重复3次，然后将上清液转移到真空歧管中（见注释5)。 (5)最后，用80μl的洗脱液静止孵育琼脂糖微球20min，将蛋白质从琼脂糖微球中洗脱出来，洗脱液过滤转移到一个新鲜的96孔板上（见注释6)。 (6)蛋白质在4°C下保存。 (7)纯化的蛋白质可被分离，如用15%的聚丙烯酰胺凝胶（图28-2)。蛋白浓度用Bradford蛋白质分析方法确定。 运用上述方法，我们获得了平均浓度约为100μg/ml的纯化蛋白质（数据未显示）。 3.2构建植物蛋白质芯片 我们将FAST点样片基用作构建植物蛋白质芯片的表面，进行抗体分析或蛋白磷酸化研究(见第29章)。  (1)在构建芯片之前，先将20μl的纯化植物蛋白和对照（见注释8)转移到384孔板上。 (2)FAST芯片片基放在QArmy芯片检测系统上，此芯片检测系统带湿度控制器(65%~70%)和16个顶端直径为150μm的钝头不镑钢，针距为4.5mm。我们采用120μm的点深度。 (3)每个样品上样一次，每个点上样量为0.6nL。 (4)每一次点样后，点样器要用双蒸水清洗（6s)，热风机吹干（2s)，再用80%的乙醇清洗（6s)，再次吹干，防止交叉污染。 (5)蛋白质芯片在密闭的片基盒中，4°C保存。 蛋白质可以不同的模板形式点样，如4X4、8X8、10X10等（见注释9)。同样，蛋白质也可以重复点样，如2次，4次或多次等。研究抗体和抗原之间的相互作用，建议在两个相同的区域在水平方向上点样2次（见注释10)。 用这个方法构建的植物蛋白质芯片可用来进行抗体分析研究，在4°C保存时至少能在3星期内提供可重复的结果。此外，这种植物蛋白质芯片还可用于蛋白激酶磷酸化的研究[8，33]，本书中已有详细的介绍（见第29章)。 为了检测固定在蛋白质芯片片基上的重组植物蛋白，按照如下方法（见28.3.3节1)将芯片片基孵育在抗RGS-His6的抗体中。图28-3举例说明了一个含有从一个cDNA表达文库中表达和纯化获得的96个拟南芥蛋白质的芯片[33]，蛋白质以4X4模式，在两个相同的区域，水平方向上重复点样，所有的重组蛋白发出一个信号，显示蛋白质表达和纯化效率，同时也说明被转移到芯片上的样品量足以用来检测芯片上的被测重组蛋白质（图28-3)。  3.3蛋白芯片上的抗体筛选 1.FAST点样片基上的单克隆抗体筛选 (1)植物蛋白质芯片在室温下用2%的BSA/TBST封闭处理1h。 (2)将小鼠抗RGS-His6(1:2000稀释）或植物特异抗体（如大鼠抗TCP1抗体；1:1000稀释）稀释在封闭液中（见注释11)。 (3)用TBST冲洗2次，每次10min。 (4)将芯片片基与相应的Cy3标记的第二抗体（兔抗小鼠IgG配抗RGS-His6—抗；兔子抗大鼠IgG配抗TCP1抗体）室温下孵育1h，这些二抗以1:800的比例稀释在封闭液中（见注释13和注释14)。 (5)用TBST冲洗3次，每次30min(见注释15)。 (6)在扫描之前，我们用微孔板离心机甩干芯片（Eppendorf，Hamburg，Germany，产品目录号：5810R) 或人工吹干。 (7)用428Arrayscanner扫描仪或ScanArray 4000扫描仪检测信号。 所有抗体孵育步骤都要在盖板下的200μl孔中进行。 为了排除二抗的非特异结合，我们进行了一组平行实验，即，将蛋白质芯片置于不含一抗的封闭液中孵育接着用相应的二抗进行孵育，包括上述的冲洗步骤。 图28-4显示了用单克隆抗TCP1抗体孵育一个拟南芥蛋白质芯片后的荧光图像。96个通过全长cDNA表达克隆获得的拟南芥蛋白质吸附在FAST点样片基上（4X4点样模式，在两个相同的区域中，水平方向上重复2次点样)。这张图显示抗TCP1抗体仅特异识别TCp1蛋白点，并且不会与其他吸附的拟南芥蛋白质发生交叉反应（图28-4)。  2. FAST点样片基上的多克隆抗体筛选 (1)FAST点样片基室温下在鱼胶（10%溶解在TBST中）中封闭处理1h。 (2)将兔血清稀释在封闭液中（如抗DOF11的稀释比例为1:1000，抗MYB6血清的稀释比例为1:500)，然后室温下，用其孵育芯片点样片基1h。 (3)用TBST冲洗2次，每次10min。 (4)点样片基在室温下用羊抗兔子IgG-Cy3配体继续孵育1h，配体以1:800的比例稀释在封闭液中（见注释13)。 (5)用TBST冲洗3次，每次30min。 (6)在扫描之前，我们用微孔板离心机甩干芯片（Eppendorf，Hamburg，Germany，产品目录号：5810R) 或人工吹干。 (7)用428Arrayscanner扫描仪或ScanArray4000扫描仪检测信号。所有抗体孵育步骤都要在盖板下的200μl孔中进行。 3.4图像分析 点的平均强度数据（扣除背景）可通过GenePixPro4.0获得；如果要做进一步的比较，强度平均值可通过计算重复的点获得。 |
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发布于 ： 2021-08-27
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