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最近我想筛选一个针对膜蛋白的单克隆抗体，这个抗体的参考文献中提到的一种筛选方法是用DNA质粒直接免疫小鼠，然后再脾融合筛选出来的。这里有几个问题想向大家请教一下：
1.DNA效果比蛋白差很远，但是膜蛋白的抗体有可能是针对空间构象的，能起效的抗体位点很少，所以要在免疫阶段保证抗体多样性和特异性。看参考文献的剂量都是25ug或者50ug这种比较低的剂量，免疫次数2-3次，最后在融合前用细胞加免一次。而我设计的实验组是100ug剂量，免疫了4-5次，我这样是不是筛不出来特异性的抗体了？
2.DNA筛到的阳性抗体，可能亲和力低，如果不想筛到IgM的抗体，DNA免疫从什么时候开始由IgM转换成IgG的？抗体多样性在免疫的什么阶段比较高？
实验外包单克隆抗体在现代生物医学中的作用越来越大，它不仅被广泛应用于生化和免疫检测，而且治疗癌症和自体免疫疾病的单抗药物也逐渐批准上市。因此单抗的制备和筛选具有其内在的重要性。
动物免疫
取4只6周龄雌性BALB/c小鼠皮下注射抗原（20μg/只），第一次免疫与等量弗氏完全佐剂乳化，0.2mL/只；两周后进行第二次免疫，抗原与等量弗氏不完全佐剂乳化，皮下注射，0.2mL/只；两周后进行第三次免疫，免疫方法及剂量同第二次免疫。第三次免疫一周后，小鼠眼眶采血测其效价，第三次免疫两周后，选择效价最高的小鼠，用不加佐剂的抗原加强免疫，3d后取小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合。
细胞融合
1骨髓瘤细胞的准备
选择生长状态良好的SP2/0细胞，覆盖瓶底80％时弃上清，以不完全培养基洗涤一次后，用l0mL不完全培养基将细胞轻轻吹下。
2脾淋巴细胞的准备
取加强免疫后3天的小鼠，摘除眼球采血作为阳性血清；颈脱臼将小鼠致死，用75%酒精消毒体表10min，随即放入超净台内的解剖板上，腹部朝上，四肢固定；无菌打开腹腔取出脾脏，用基础培养基洗涤，并仔细去掉周围附着的结缔组织；随后将脾脏转移到另一个盛有DMEM的平皿中。用研磨棒挤压，使脾细胞充分释放，制成脾细胞悬液。
3饲养细胞的制备
取一只成熟健康的ICR小鼠，摘眼球采血作为阴性血清，颈脱臼处死；体表消毒和固定后，暴露腹膜，酒精棉球消毒腹膜；用l0mL注射器，12#针头，吸取10mLHAT培养基到腹腔，右手固定注射器，左手持酒精棉球轻轻按摩腹部，抽回腹腔内液体，注入己准备好的容器中。
4融合
将上述制备的骨髓瘤细胞与脾细胞混合于一支50mL的带盖的融合管中，1000rpm离心10min，弃上清。将融合管置于手掌中，轻轻摩擦底部，使两种细胞充分混匀；在37°C水浴中45s内缓慢加入1mL预热的PEG-1500到融合管中，边加边轻轻摇匀；随即在90s内先慢后快滴加30mL37°C预热的不完全DMEM培养基，使PEG稀释而失去作用，37°C静置10min，1000rpm离心10min；弃上清，用60mLHAT培养基轻轻悬浮沉淀细胞，再加入适量的腹腔巨噬细胞；分装于96孔细胞培养板，然后将培养板置37°C6%CO2培养箱内培养；5d后用新鲜的HAT培养基换出一半培养基；10d后用预热的HT换出HAT；观察杂交瘤细胞的生长情况，待其细胞培养上清变黄或克隆分布至孔底面积的1/10以上时，吸取适量细胞上清进行ELISA检测,两次检测结果为阳性设为阳性克隆孔。
杂交瘤细胞的克隆化及建株
采用有限稀释法对连续两次检测为阳性的细胞株进行克隆化。阳性细胞计数，取100个细胞放入5mL含饲养细胞的培养液中，即20个细胞/mL，100μL/孔滴加于96孔细胞培养板，即每孔1个细胞：再将余下的细胞悬液倍比稀释，细胞数为10个/mL，100μL/孔滴加于96孔细胞培养板，即每孔0.5个细胞。第8～9d时，肉眼可见细胞克隆，对出现单个细胞克隆的孔再按筛选阳性杂交瘤细胞的间接ELISA方法进行筛选。连续进行三次以上亚克隆，判为阳性的细胞株扩大培养，建株冻存。
在过去的20年，单克隆抗体逐渐成为癌症治疗中的支柱。从最初应用价值有限的鼠源单抗到最近新的CAR-T技术，研究者们不停地摸索改进创新。最近一期的《NatureReviewsCancer》杂志刊登了基于单抗的癌症疗法综述。文章从四个方面介绍了单抗在癌症治疗里的用途。
癌细胞靶向疗法：恶性肿瘤细胞表面表达着一些异于普通健康细胞的抗原，这些抗原可以作为单克隆抗体的良好靶点。体外与动物体内的实验显示，针对这些靶点的抗体可以引起细胞的凋亡，并通过补体介导的细胞毒性(complement-mediatedcytotoxicity,CMC)以及抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(antibody-dependentcellularcytotoxicity,ADCC)杀死靶细胞。但是在不同临床实验中，具体是哪一种机制更为重要还有待研究.
改变宿主体内应答：VEGF等血管内皮生长因子促进肿瘤内血管生长(angiogenesis)，为肿瘤提供优越的生长环境。因此通过抑制VEGF来抑制血管生成的抗体如Bevacizumab等成为有效的抗癌药物。但由于其不能直接作用于癌细胞，此类抗体药物通常与其他具有细胞毒性的药物结合使用。另一个方法是T细胞检验点阻断(Tcellcheckpointblockade)。在T细胞免疫中，配体和受体的共调控在肿瘤特异性T细胞的激活和抑制中起着重要作用。精确控制的T细胞检验点影响免疫系统的反应，避免免疫系统过度激活。抑制这些检验点的单抗被叫做检验点阻断抗体，它们可以诱导更强的肿瘤免疫反应，使反应维持更久的时间。目前常用的抗体包括阻断CTLA4的Ipilimumab和PD1的抗体pembrolizumab和nivolumab。PD1抗体在何杰金淋巴瘤的初期临床实验中显示出很好的效果.
运输具有细胞毒性的分子：近年来，“智能炸弹”(smartbomb)被用来描述这一系列向癌细胞运输细胞毒性分子的单抗。这些分子包括放射免疫偶联物，具有细胞毒性的小分子以及免疫系统里的细胞因子。放射性元素被用于标记抗体，进行肿瘤的诊断和治疗。淋巴瘤是较为适合放射性疗法的癌症，目前被FDA批准的药物有ibritumomabtiuxetan和tositumomab。抗体-药物偶联物(antibody-drugconjugates)是最近研发的极具前景的抗癌药物。它将带有细胞毒性的药物和具有特异性的抗体偶联，提高了特异性同时更好地杀死肿瘤细胞。此外免疫细胞因子如IL-2和GM-CSF也被结合用在抗体上，用于靶向肿瘤细胞，改变肿瘤微环境.
重塑T细胞：T细胞免疫在肿瘤免疫里起着关键的作用。目前有两大类方法让T细胞不再受T细胞受体识别抗原的MHC分子的限制。第一类方法是双特异性抗体(bispecificantibody)，顾名思义，它既可以靶向细胞又可以结合免疫效应细胞，例如T细胞和NK细胞。目前针对CD19抗原的双特异性抗体blinatumomab已经被FDA批准，更多抗体还在研发中。第二类方法是嵌合抗原受体T细胞(chimericantigenreceptorTcells)，即大名鼎鼎的CAR-T细胞。这类被修饰过的T细胞包含具有特异性的抗体可变区和T细胞激活的基序，能够进攻表达特异抗原的细胞。CAR-T细胞可以分裂生长，并保持肿瘤细胞特异性。目前CAR-T细胞疗法在临床实验中取得了非常显著的疗效。尽管随之而来的细胞因子风暴会带来一定危险，不过使用细胞因子的抗体可以减轻它的负面影响。CAR-T实验的经验还在不断积累，未来这一技术将渐渐成熟。
我先开个头
泊落沙姆188，土温80
（1）鼠源单克隆抗体的生产应用的动物细胞工程技术有动物细胞培养、动物细胞融合等．
（2）据图可知，免疫原性的产生主要与抗体的 C区有关．
（3）基因嵌合表达载兼具有淋巴细胞和体细胞的特点，体转染成功的细胞应该具有的特点是：分泌抗体和无限增殖能力．
（4）嵌合抗体的生产属于蛋白质工程范畴．图示中的嵌合抗体具有特异性，能比较有效的治疗肿瘤．
(1)杂交瘤可以在体外“永久”地存活并传代，只要不发生细胞株的基因突变，就可以不断地生产高特异性、高均一性的抗体。
(2)可以用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。
(3)由于可能得到“无限量”的均一性抗体，所以适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法，如IRMA和ELISA等。
(4)由于单克隆抗体的高特异性和单一生物学功能，可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗。
2．单克隆抗体的局限性
(1)单克隆抗体固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围。由于单克隆抗体不能进行沉淀和凝集反应，所以很多检测方法不能用单克隆抗体完成。
(2)单克隆抗体的反应强度不如多克隆抗体。
(3)制备技术复杂，而且费时费工，所以单克隆抗体的价格也较高。向左转|向右转
求助：看了许多文献，对于免疫小鼠的抗原剂量以及方法各不相同，所以发帖问问大家制备单抗的详细过程，谢谢大家
