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临床常用的单克隆抗体靶向药物包括：
①抗CD20单抗，利妥西单抗；
②抗表皮生长因子受体（EGFR)单抗，西妥昔单抗、帕尼单抗（Panitumab);
③抗Her-2单抗，曲妥珠单抗；
④抗VEGF单抗，贝伐珠单抗（Avastin)等。

单克隆抗体是由B淋巴细胞分化形成的浆细胞合成、分泌的。每一个B淋巴细胞在成熟的过程中通过随机重排只产生识别一个抗原的抗原受体基因。动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，重排后具有不同基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。被激活的B细胞分裂增殖形成效应B细胞（浆细胞）和记忆B细胞，大量的浆细胞克隆合成和分泌大量的抗体分子分布到血液、体液中。如果能选出一个制造一种专一抗体的浆细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成针对一种抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体。要制备单克隆抗体需先获得能合成专一性抗体的单克隆B淋巴细胞，但这种B淋巴细胞不能在体外生长。而实验发现骨髓瘤细胞可在体外生长繁殖，应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性，它既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。
有什么不明白的请追问

最近我想筛选一个针对膜蛋白的单克隆抗体，这个抗体的参考文献中提到的一种筛选方法是用DNA质粒直接免疫小鼠，然后再脾融合筛选出来的。这里有几个问题想向大家请教一下：

1.DNA效果比蛋白差很远，但是膜蛋白的抗体有可能是针对空间构象的，能起效的抗体位点很少，所以要在免疫阶段保证抗体多样性和特异性。看参考文献的剂量都是25ug或者50ug这种比较低的剂量，免疫次数2-3次，最后在融合前用细胞加免一次。而我设计的实验组是100ug剂量，免疫了4-5次，我这样是不是筛不出来特异性的抗体了？

2.DNA筛到的阳性抗体，可能亲和力低，如果不想筛到IgM的抗体，DNA免疫从什么时候开始由IgM转换成IgG的？抗体多样性在免疫的什么阶段比较高？

当获得产生所需的单克隆抗体的杂交瘤细胞后，必须将一部分杂交瘤细胞保存，否则在连续传代的过程中，可能产生突变或染色体的漂移以至丧失固有特性或丢失产生抗体的特性。另外在长期的培养过程中，难免不发生污染以至于毁灭。所以必须冷藏保存一部分。保存方法如下：
1．材料
(1) 细胞：取对数生长期的细胞。
(2) 10％二甲基亚砜保护液（二甲基亚砜能损坏滤器，而又被高压所破坏，所以不能过滤或高压消毒。其本身就是毒品，无菌）：含10％二甲基亚砜、20％灭活胎牛血清，70％RPMI—1640液。
(3) 20％FCS—1640培养液：含青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml。
(4) 灭菌的2ml安瓶等
2．操作方法
(1) 去掉细胞培养瓶中的旧的培养液，加入10％FCS—1640液，使细胞悬浮。
(3) 1 000r/min离心10min，去上清。细胞沉淀用10％二甲基亚砜保护液制成悬液，使成1.0×107细胞／ml。
(3) 取样，台盼兰染色，计数活细胞，应在95％以上。
(4) 用器将细胞分装安瓶，每瓶0.5ml～1.0ml，熔封安瓶。
(5) 放4℃ 2h。
(6) 放液氮罐气态部分（-70℃）15h。
(7) 转入液氮部分。

复苏
1．从液氮罐中取出安瓶立即放37℃水浴中速溶。
2．无菌操作打开安瓶，取出细胞悬液，转入组织培养瓶。
3．逐滴缓慢加入20％FCS－1640培养液3.5ml，这个过程延续3min。
4．5％CO2饱和湿度，37℃培养。
5．4h后弃去培养液上清，加入新鲜的20％FCS－1640培养液。
6．继续培养，换液，以至形成单层。

最近准备做单克隆抗体，诚意求购sp2/0细胞，或告知哪里购买比较可靠呢？

此外，想咨询一下sp2/0和sp2/0-Ag14到底哪一个适合做细胞融合？看资料很多都说是sp2/0-Ag14细胞，但是咨询一些公司细胞特性都写明sp2/0-Ag14是悬浮生长的，可是我清楚记得之前做单抗用的小鼠骨髓瘤细胞是都是贴壁生长的，但是贴壁不牢可以直接吹下来不用胰酶消化的，这不是很矛盾吗，求教高手解答！！！！

单克隆抗体制备的原理：B淋巴细胞在抗原的刺激下,能够分化、增殖形成具有针对这种抗原分泌特异性抗体的能力、B细胞的这种能力和量是有限的,不可能持续分化增殖下去，因此产生免疫球蛋白的能力也是极其微小的、将这种B细胞与非分泌型的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，再进一步克隆化，这种克隆化的杂交瘤细胞是既具有瘤的无限生长的能力，又具有产生特异性抗体的B淋巴细胞的能力，将这种克隆化的杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠体内即可获得大量的高效价、单一的特异性抗体.这种技术即称为单克隆抗体技术。单克隆抗体制备的过程：免疫动物免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的 过程。 一般选用6-8周龄雌性BALB/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。 抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞。细胞融合采用二氧化碳气体处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。 将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。选择性培养选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞，一般采用HAT选择性培养基。在HAT培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，不能利用补救途径合成DNA而死亡。 未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。 只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能在HAT培养基中存活和增殖。杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养。采用灵敏、快速、特异的免疫学方法，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增。经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后，及时进行冻存。单克隆抗体的大量制备单克隆抗体的大量制备主要采用动物体内诱生法和体外培养法。(1)体内诱生法 取BALB/c小鼠，首先腹腔注射0.5ml液体石蜡或降植烷进行预处理。1-2周后，腹腔内接种杂交瘤细胞。杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖，并产生和分泌单克隆抗体。约1-2周，可见小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可获得大量单克隆抗体。(2)体外培养法 将杂交瘤细胞置于培养瓶中进行培养。在培养过程中，杂交瘤细胞产生并分泌单克隆抗体，收集培养上清液，离心去除细胞及其碎片，即可获得所需要的单克隆抗体。但这种方法产生的抗体量有限。各种新型培养技术和装置不断出现，大大提高了抗体的生产量。单克隆抗体制备的意义：用于以下各种生命科学实验并具有医用价值（1）沉淀反应：Precipitation reaction（2）凝集实验：haemaglutination（3）放射免疫学方法检测免疫复合物（4） 流式细胞仪：用于细胞的分型和细胞分离.（5）ELISA 等免疫学检测（6）BIAcore biosensor:检测Ab-Ag或与蛋白的亲和力 .（7）免疫印记（western blotting)（8） 免疫沉淀：（9） 亲和层析：分离蛋白质（10） 磁珠分离细胞（11）临床疾病的诊断和治疗；

大家好，最近在做单抗，里面有些问题一直想不通，我想请大神帮忙一下，想问一下饲养细胞加少了是大概多少，我一直6周龄的balb/C，刚拿回来就取饲养细胞了，然后取了3毫升，注射到60毫升的HAT中铺了六块板子，这个量多么，么有细胞计数，至今细胞计数不是很会，去想问你们第二天去看板子是时候，底下会有雾一样的细胞么，细胞多的地方你们的液体上清会有点变色么，要一点不变色的是好的，还是细胞上清稍微变色是正常的呢谢谢大神指导

基因工程抗体是继多克隆抗体和单克隆抗体之后的第三代抗体,主要包括两部分:一是对已有的单克隆抗体进行改造,包括单克隆抗体的人源化(嵌合抗体、 人源化抗体)、 小分子抗体 ( Fab ,Sc Fv ,dsFv ,diabody ,m i ni body等)以及抗体融合蛋白的制备; 二是通过抗体库的构建,使得抗体不需抗原免疫即可筛选并克隆新的单克隆抗体.
鼠源性抗体应用于人体会产生抗鼠抗体反应(HAMA )等,妨碍其在临床上的应用,所以要制备人鼠杂交和完全人源化的抗体,减少抗体中的鼠源成分,尽量保留原有抗体的特异性.

在单克隆抗体制备过程中，多种抗体都是针对同一个抗原的，应该都能识别的啊，阳性是指识别达到一定的量吗，还是其他的抗体一点都不能识别了？

单抗制备中SP/20和小鼠脾细胞融合是的比例是1:5左右，但是融合完后铺96孔细胞板，怎样才能保证最后每空长出一个细胞团？求大神指点，

在过去的20年，单克隆抗体逐渐成为癌症治疗中的支柱。从最初应用价值有限的鼠源单抗到最近新的CAR-T技术，研究者们不停地摸索改进创新。



在过去的20年，单克隆抗体逐渐成为癌症治疗中的支柱。从最初应用价值有限的鼠源单抗到最近新的CAR-T技术，研究者们不停地摸索改进创新。最近一期的《NatureReviewsCancer》杂志刊登了基于单抗的癌症疗法综述。文章从四个方面介绍了单抗在癌症治疗里的用途。
癌细胞靶向疗法：恶性肿瘤细胞表面表达着一些异于普通健康细胞的抗原，这些抗原可以作为单克隆抗体的良好靶点。体外与动物体内的实验显示，针对这些靶点的抗体可以引起细胞的凋亡，并通过补体介导的细胞毒性(complement-mediatedcytotoxicity,CMC)以及抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(antibody-dependentcellularcytotoxicity,ADCC)杀死靶细胞。但是在不同临床实验中，具体是哪一种机制更为重要还有待研究.
改变宿主体内应答：VEGF等血管内皮生长因子促进肿瘤内血管生长(angiogenesis)，为肿瘤提供优越的生长环境。因此通过抑制VEGF来抑制血管生成的抗体如Bevacizumab等成为有效的抗癌药物。但由于其不能直接作用于癌细胞，此类抗体药物通常与其他具有细胞毒性的药物结合使用。另一个方法是T细胞检验点阻断(Tcellcheckpointblockade)。在T细胞免疫中，配体和受体的共调控在肿瘤特异性T细胞的激活和抑制中起着重要作用。精确控制的T细胞检验点影响免疫系统的反应，避免免疫系统过度激活。抑制这些检验点的单抗被叫做检验点阻断抗体，它们可以诱导更强的肿瘤免疫反应，使反应维持更久的时间。目前常用的抗体包括阻断CTLA4的Ipilimumab和PD1的抗体pembrolizumab和nivolumab。PD1抗体在何杰金淋巴瘤的初期临床实验中显示出很好的效果.
运输具有细胞毒性的分子：近年来，“智能炸弹”(smartbomb)被用来描述这一系列向癌细胞运输细胞毒性分子的单抗。这些分子包括放射免疫偶联物，具有细胞毒性的小分子以及免疫系统里的细胞因子。放射性元素被用于标记抗体，进行肿瘤的诊断和治疗。淋巴瘤是较为适合放射性疗法的癌症，目前被FDA批准的药物有ibritumomabtiuxetan和tositumomab。抗体-药物偶联物(antibody-drugconjugates)是最近研发的极具前景的抗癌药物。它将带有细胞毒性的药物和具有特异性的抗体偶联，提高了特异性同时更好地杀死肿瘤细胞。此外免疫细胞因子如IL-2和GM-CSF也被结合用在抗体上，用于靶向肿瘤细胞，改变肿瘤微环境.
重塑T细胞：T细胞免疫在肿瘤免疫里起着关键的作用。目前有两大类方法让T细胞不再受T细胞受体识别抗原的MHC分子的限制。第一类方法是双特异性抗体(bispecificantibody)，顾名思义，它既可以靶向细胞又可以结合免疫效应细胞，例如T细胞和NK细胞。目前针对CD19抗原的双特异性抗体blinatumomab已经被FDA批准，更多抗体还在研发中。第二类方法是嵌合抗原受体T细胞(chimericantigenreceptorTcells)，即大名鼎鼎的CAR-T细胞。这类被修饰过的T细胞包含具有特异性的抗体可变区和T细胞激活的基序，能够进攻表达特异抗原的细胞。CAR-T细胞可以分裂生长，并保持肿瘤细胞特异性。目前CAR-T细胞疗法在临床实验中取得了非常显著的疗效。尽管随之而来的细胞因子风暴会带来一定危险，不过使用细胞因子的抗体可以减轻它的负面影响。CAR-T实验的经验还在不断积累，未来这一技术将渐渐成熟。

鼠单克隆抗体McAb应用于人体存在着严重的缺陷: 血清中半寿期短；仅有部分不同亚类的抗体能引发效应功能；最大的障碍是诱发HAMA反应。McAb诱导的内源性抗体基本上可分两类:抗个体型(anti-idiotype)和抗同种型(anti-isotype)。前者通过中和抗原结合位点而消除了McAb的能力;后者除了加速McAb的清除外,还会在诊断时引起假阳性,还可能引起过敏性休克。
（1）鼠源单克隆抗体的生产应用的动物细胞工程技术有动物细胞培养、动物细胞融合等．
（2）据图可知，免疫原性的产生主要与抗体的 C区有关．
（3）基因嵌合表达载兼具有淋巴细胞和体细胞的特点，体转染成功的细胞应该具有的特点是：分泌抗体和无限增殖能力．
（4）嵌合抗体的生产属于蛋白质工程范畴．图示中的嵌合抗体具有特异性，能比较有效的治疗肿瘤．