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各位业内前辈，我们正在考虑引进符合GMP认证标准的CHO细胞系，用于表达可做疫苗生产的重组蛋白类。目前已有符合标准信息的是Thermofisher的CHO-S悬浮培养细胞资料，希望能再多了解一些和这株细胞类似的其他公司符合GMP标准的生产株细胞做个比较。谢谢指教！

无细胞蛋白表达系统又称为体外翻译系统，是模拟生物细胞的生命现象，重现胞内蛋白转录翻译过程。无细胞蛋白质合成体系以外源目的mRNA或DNA为蛋白质合成模板，通过人工控制补加蛋白质合成所需的底物和转录、翻译相关蛋白因子等物质，能实现目的蛋白质的体外蛋白合成。
1. 金开瑞的与传统的蛋白表达系统相比，省略了耗时耗力的质粒转化、细胞培养、收集、破碎和离心等, 极大地提高了工作效率；
2. 反应体系小，能同时平行合成多种不同的蛋白质；
3. 反应周期短，能满足高通量配体筛选和蛋白质组学的科研要求；
4. 开放的反应体系，便于改变各项反应条件，有利于调控基因的转录，蛋白质的合成和翻译后修饰，避免包涵体的形成；
5. 稳定的反应体系，可以偶联其它工艺，形成自动化、程序化、规模化生产，加快重组蛋白的纯化、功能表征和后续的结构解析；
6. 无细胞结构限制，可用于生产对宿主有毒害作用的外源蛋白，避免蛋白表达对宿主细胞的致死作用；
7. 添加非天然氨基酸或同位素标记氨基酸，表达特殊蛋白。
8.对于多次跨膜或由于疏水性强导致的普通细胞系表达困难的项目有显著改善。

举例如下，分别的特点，可以分别百度搜索查看。
▷ 重组蛋白生产平台
▪ HEK293细胞瞬转
▪ CHO细胞
▪ 昆虫细胞/杆状病毒
▪ 酵母细胞
▪ 大肠杆菌发酵

蛋白质重组，先要全部水解为氨基酸，蛋白质的种类多就是因为它的数量大，结构复杂，空间结构千变万化。而基本的氨基酸只有20中，所以它重组以后就可能变成完全不同的东西，控制和以前完全无关的代谢过程。
基因重组只是控制同一性状表达不同而已，但是它不会改变性状的基本情况。如：控制眼睛颜色的基因，亲本的基因重组之后可能亲本为黑色，子代便为蓝色。但绝对不会控制眼睛颜色的基因在重组之后就变成控制耳朵的基因。

HEK293细胞表达系统，瞬时转染的话 3天左右可以初步检测表达效果，可以14天内优化表达效果。关于这个系统，有任何疑问可以咨询我 4008909989

无细胞蛋白表达系统又称为体外翻译系统，是模拟生物细胞的生命现象，重现胞内蛋白转录翻译过程。无细胞蛋白质合成体系以外源目的mRNA或DNA为蛋白质合成模板，通过人工控制补加蛋白质合成所需的底物和转录、翻译相关蛋白因子等物质，能实现目的蛋白质的体外蛋白合成。金开瑞的与传统的蛋白表达系统相比，省略了耗时耗力的质粒转化、细胞培养、收集、破碎和离心等,极大地提高了工作效率；2.反应体系小，能同时平行合成多种不同的蛋白质；3.反应周期短，能满足高通量配体筛选和蛋白质组学的科研要求；4.开放的反应体系，便于改变各项反应条件，有利于调控基因的转录，蛋白质的合成和翻译后修饰，避免包涵体的形成；5.稳定的反应体系，可以偶联其它工艺，形成自动化、程序化、规模化生产，加快重组蛋白的纯化、功能表征和后续的结构解析；6.无细胞结构限制，可用于生产对宿主有毒害作用的外源蛋白，避免蛋白表达对宿主细胞的致死作用；7.添加非天然氨基酸或同位素标记氨基酸，表达特殊蛋白。8.对于多次跨膜或由于疏水性强导致的普通细胞系表达困难的项目有显著改善。

大家好，想请教大家一个关于HPLC方法学的问题。

目前我们做的一个蛋白药，没有标准品，液相建立一个方法只想用于纯度鉴定，不去定量，这个方法所得到的图谱就一个主蛋白峰，面积归一化法相当于100%，现在就这个方法的方法学验证提出下面几点疑问：

1.因为我只做纯度鉴定，这个方法的方法学应该做系统适用性、专属性、检测限、耐用性和精密度这些，还是按照定量的全套加上定量限、线性、范围、准确度这些？

2.纯度鉴定中，我觉得应该对杂质进行定量，但是我们的这个方法只有一个主蛋白峰，几乎没有杂质峰，这样的话这个方法学我应该以什么为标准证明纯度呢？需将样品进行适当的氧化、酸、碱破坏吗？然后证明破坏后主峰能和产生的杂质分开？

3.对应生物蛋白药的杂质，应该属于无法获得的，如果通过强破坏，这个杂质也是不好鉴定的，是不是我只需要知道主峰能和强破坏的降解物分开，就可以说方法建立成功？还是生物药没有必要做这个强破坏，简单的走一下系统适用性、专属性、检测限、耐用性和精密度这样的流程就行？

说的有点乱，主要是自己对这个生物药的HPLC纯度鉴定的方法学，实在是疑惑重重，希望有经验的大侠能帮忙解答下。非常感谢！

可以跑SDS-PAGE电泳，不插梳子，每次一块板子点样200ul，跑完了切胶，攒几次之后，用灭菌的研钵研磨，边磨边加PBS，注意不要加多了，一定要研磨得很细，研磨之后用1ml的注射器过一边，不堵塞说明就可以打兔子了。每次打兔子的胶不超过1.5ml，首次蛋白的量要高一些，400-500ug，以后两次减半，一般三次就可以了。我们实验室有人做过。
或者可以过柱纯化，过柱纯化要加一半的佐剂，所以纯化后浓度要高于500ug/ml为宜，否则要增加免疫的次数。

美国Scripps研究所，ProteomTech公司，和德国马克斯普朗克分子生物医学研究所等机构的科研人员成功地利用重组蛋白诱导体细胞生成多能干细胞。较之传统的依赖于病毒载体的诱变方法，这一划时代的新方法无需使用任何形式的外源性遗传物质，从而消除了传统方法中不可避免的对靶细胞自身基因组的影响，而且更加简便快捷。这项成果已经在最近一期的"细胞·干细胞"期刊发表，并立即引起了包括华尔街日报,NBC和福布斯等在内的各大媒体的广泛关注。

人类医学发展到今天,对某些疑难疾病还是不能彻底根治,如遗传疾病，器官坏死，和糖尿病等。这些疾病仅靠药物治疗只能减缓症状，而器官移植又受捐赠器官有限和免疫排斥等因素的限制而不能推广。干细胞是唯一有可能攻克这些疾病的治疗手段。但长期以来，获取多能干细胞(pluripotentstemcell)的主要来源为人的胚胎。这引起道德和宗教的争议，进而在美国等国家受到法律限制。另外，用异己的胚胎干细胞发展的治疗手段将来还是会遇到免疫排斥的问题。

2006年，日本科学家ShinyaYamanaka领导的实验室第一次证明，通过以反转录病毒为载体转基因表达四个转录因子，可以将小鼠或人的体细胞转变为与胚胎干细胞拥有相似分化和繁殖能力的细胞，命名为诱导性干细胞（iPS）。这一成果具有划时代的意义：1）干细胞的产生可以不再需要破坏胚胎，避免了道德，宗教和法律上的限制；2）不同疾病的诱导性干细胞可衍生出不同类型的疾病模型，为基础研究和药物筛选提供了强大的武器；3）理论上，各种疑难疾病可以通过病人自己的体细胞转变为干细胞，再分化为各种类型的细胞，组织，甚至器官，经过或不经过体外加工后，放回病人体内，治愈疾病。

在本论文中，研究人员成功地用四个转录因子的蛋白完成了由体细胞到诱导性干细胞的转变过程。自始至终，细胞的遗传信息没有受到任何影响。蛋白诱导性干细胞的重大意义包括：1）安全性：转化过程没有使用病毒，没有使用基因，没有任何改变细胞遗传信息的风险；2）普及性：蛋白诱导方法远比基因诱导方法简单易行。这样一来，iPS技术不再被几个资深实验室所垄断。大部分实验室都可以重复蛋白方法而获得iPS。也就是说，蛋白诱导方法大大降低了iPS领域的"门坎"。3）可行性：由于该方法的简单易行，重复性强，它可以被扩大化，产业化，进而被商业化。蛋白诱导干细胞方法将大大降低利用干细胞对病人"量身定做"的治疗手段的成本，使得这一商业模式成为可能。

如果说，ShinyaYamanaka博士的成果第一次使人类看到了一个梦想，那么这篇论文的发表标志着我们从梦想向现实跨出了关键的一大步。
CellStemCell,23April2009doi:10.1016/j.stem.2009.04.005

GenerationofInducedPluripotentStemCellsUsingRecombinantProteins

HongyanZhou1,ShiliWu4,7,JinYoungJoo5,7,SaiyongZhu1,DongWookHan5,TongxiangLin1,SuniaTrauger2,3,GeofferyBien4,SusanYao4,YongZhu4,GarySiuzdak2,3,HansR.Sch?ler5,LingxunDuan6andShengDing1,,

1DepartmentofChemistry,TheScrippsResearchInstitute,10550NorthTorreyPinesRoad,LaJolla,CA92037,USA
2DepartmentofMolecularBIOLOGy,TheScrippsResearchInstitute,10550NorthTorreyPinesRoad,LaJolla,CA92037,USA
3CenterforMassSpectrometry,TheScrippsResearchInstitute,10550NorthTorreyPinesRoad,LaJolla,CA92037,USA
4ProteomTech,Inc.,3505CADIllacAvenue,SuiteF7,CostaMesa,CA92626,USA
5DepartmentofCellandDevelopmentalBiology,MaxPlanckInstituteforMolecularBiomedicine,R?ntgenstrasse20,Münster48149,Germany
6LD***aInc.,SandownWay,SanDiego,CA92130,USA
7Theseauthorscontributedequallytothiswork

Groundbreakingworkdemonstratedthatectopicexpressionoffourtranscriptionfactors,Oct4,Klf4,Sox2,andc-Myc,couldreprogrammurinesomaticcellstoinducedpluripotentstemcells(iPSCs)(TakahashiandYamanaka,2006),andhumaniPSCsweresubsequentlygeneratedusingsimilargeneticmanipulation(Takahashietal.,2007,Yuetal.,2007).Toaddressthesafetyissuesarosefromharboringintegratedexogenoussequencesinthetargetcellgenome,anumberofmodifiedgeneticmethodshavebeendevelopedandproducediPSCswithpotentiallyreducedrisks(fordiscussion,seeYamanaka,2009,andreferencestherein).However,allofthemethodsdevelopedtodatestillinvolvetheuseofgeneticmaterialsandthusthepotentialforunexpectedgeneticmodificationsbytheexogenoussequencesinthetargetcells.Herewereportgenerationofprotein-inducedpluripotentstemcells(piPSCs)frommurineembryonicfibroblastsusingrecombinantcell-penetratingreprogrammingproteins.WedemonstratedthatsuchpiPSCscanlong-termself-renewandarepluripotentinvitroandinvivo.

不同重组蛋白可以用于多种细胞的作用研究，例如最近很火的细胞治疗就是用细胞因子（重组蛋白）对免疫细胞（不同细胞）进行刺激，从而增加其数量以及肿瘤杀伤作用的。

美迪西

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考研细胞的题答案